"第五种碱基"——5-甲基胞嘧啶

研究背景

5-甲基胞嘧啶是核酸化学学科的热点研究课题，它与许多生命活动息息相关，并且涉及到了很多疾病的病理学研究，因此被称为"第五种碱基"[1]。作为DNA的正常组份，5-甲基胞嘧啶只占全部胞嘧啶的3%左右，在人类DNA中约占3.5～4.4%。在它的3'侧常与鸟嘌呤为邻，90%以上的5~C是以5'-5~mCG-3'的顺序排在DNA中，因为5~mC与G相邻，对侧股按5'→3'方向也是5'-5~mCG-3'，故5~mCG在DNA中是对称的[2]。

5-甲基胞嘧啶在化学修饰中扮演中至关重要的角色，早期的观点认为这种修饰是静态不变且只起到调控作用的。然而，近期的研究越来越表明5-甲基胞嘧啶在真核生物的一系列细胞内反应中发挥着关键或必要的条件[3]。

合成方法

5-甲基胞嘧啶是一个非常重要的医药中间体，常用来制备抗病毒和抗肿瘤等药物。关于该物质的合成，可以5-甲基脲嘧啶为原料，先与三氮唑反应制得中间体5-甲基-4-(1,2,4-三氮唑)-嘧啶-2-酮，接着该中间体在浓氨水的作用下水解生成。总收率为24.4%[4]。

检测方法

文献报道了一种检测DNA中5-甲基胞嘧啶的化学方法。该方法采用的两种化合物分别为取代的苯磺酰氯胺钠盐和取代的苯磺酰溴胺钠盐，具体检测步骤如下：先用取代的苯磺酰氯胺钠盐与带荧光标记的DNA中的胞嘧啶反应，再用取代的苯磺酰溴胺钠盐与带荧光标记的DNA中的胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶反应，然后用哌啶处理，通过比较DNA聚丙烯酰胺变性胶中两个反应的DNA带，可以清楚的看到5-甲基胞嘧啶的位置和个数[5]。

有关研究

分离研究

通过不同流动相，测定温度，流速的对比，优化分离烟叶总DNA中胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的高效液相色谱法。烤烟烟叶DNA采用CTAB法提取，高氯酸水解，用KOH调节pH到3~5，取上清液测定。色谱柱为Nuc leosil C18(250 mm×4.6 mm,5μm)。优化后测定条件为：流动相采用甲醇:5 mmol/L戊烷磺酸钠(10:90,V/V)，流速0.7 ml/min，柱温30℃，检测波长273 nm，进样量20μl。该方法简化了流动相的配制，缩短了分离时间，胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的加标回收率分别为103.50%和96.67%，相对标准偏差为2.35%和2.80%。用该方法研究烤烟烟叶发育过程中总DNA胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的含量，效果良好，符合烟叶生长发育规律[6]。

水解反应研究

采用密度泛函理论方法在B3LYP/6-31G**水平下研究5-甲基胞嘧啶水解反应的微观机理和势能剖面。计算结果表明，5-甲基胞嘧啶的水解反应有两条反应途径：(A)水分子进攻5-甲基胞嘧啶生成中间体IM1，然后氨分子充当桥生成终产物胸腺嘧啶；(B)水分子进攻5-甲基胞嘧啶首先生成四配位的中间体IM2，然后中间体分解成终产物胸腺嘧啶和氨分子。能量计算结果表明，5-甲基胞嘧啶的水解反应决速步的活化能垒较高，在自发状态下，5-甲基胞嘧啶的水解反应难于进行[7]。

复合物异构化研究

采用B3LYP/6-311+G(d)及MP2 /6-311+G(d)计算方法对5-甲基胞嘧啶与BH3所形成复合物及异构化反应进行研究，获得了6种复合物及4个异构化过渡态。在考虑基组重叠误 差校正基础上，得到了结合能及变形能等信息，并用自然键轨道分析法讨论了其相互作用情况。结果表明，BH3与5-甲基胞嘧啶中N(3)，O及N(4)相连 形成稳定复合物a，b1，b2和c，其结合能分别为104.58，92.25，63.49和43.41 kJ·mol^-1。复合物a，b1，b2，c和d既可通过BH3与5-甲基胞嘧啶不同部位结合直接生成，也可通过BH3整体迁移实现相互转化，甲基化对复 合物稳定性及相互异构化能垒无明显影响[8]。

参考文献

[1]吴凡,周翔.基于连接酶链式反应检测5-甲基胞嘧啶[C]//全国化学生物学学术会议.2017.

[2]蒋栋良.5-甲基胞嘧啶与化学致癌[J].国外医学(分子生物学分册), 1985(3).

[3]刘卓,潘攀.5-甲基胞嘧啶——高等生物的主要表观遗传标记[J].医药前沿 2018年8卷1期, 25-26页, 2018, 8(1):25-26.DOI:10.3969/j.issn.2095-1752.2018.01.017.

[4]单绍军,李心恬,黄善东,等.5-甲基胞嘧啶的合成[J].辽宁化工, 2010(6):2.DOI:10.3969/j.issn.1004-0935.2010.06.005.

[5]周翔,王天露,翁小成.一种检测DNA中5-甲基胞嘧啶的化学方法:CN201210427481.5[P].CN102912024A.

[6]贾峰,魏庆华,杜铮,等.烤烟烟叶胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶分离条件的优化[J].山东农业科学, 2010(6):4.DOI:10.3969/j.issn.1001-4942.2010.06.029.

[7]张爱华 杨宝华 李琳.5-甲基胞嘧啶水解反应机理的理论研究[J].信阳师范学院学报(自然科学版), 2014(27):343.DOI:10.3969/j.issn.1003-0972.2014.03.008.

[8]靳玲侠,王文亮,吴东兵,等.5-甲基胞嘧啶-BH3复合物构型及异构化机理的理论研究[J].化学学报, 2007, 65(11):7.DOI:10.3321/j.issn:0567-7351.2007.11.003.