PYK2抗体的应用

背景^[1-3]

PYK2抗体是一种IgG2bκ小鼠单克隆p-PYK2抗体，它通过蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫荧光、免疫组织化学（P）和酶联免疫吸附试验检测人源Tyr 402磷酸化的PYK2。p-PYK2抗体（13.Tyr 402）既有偶联形式，也有非偶联形式的抗p-PYK2抗体。PYK2（富含脯氨酸的酪氨酸激酶2）是FAK家族的假定成员，在其激酶结构域内与FAK具有61%的序列同一性。与FAK一样，PYK2已被证明是一种细胞质蛋白酪氨酸激酶，它是pp60Src的内在蛋白酪氨酸激酶活性的底物。PYK2（也称为CAKb或RAFTK）在中枢神经系统中高度表达。PYK2在酪氨酸残基上迅速磷酸化以响应刺激，从而增加细胞内钙水平，进而激活PKC家族激酶的成员。具体来说，PYK2在刺激后的Tyr 402上被磷酸化。这促进了介导Src对p190 RhoGAP磷酸化的多蛋白复合物的形成。PYK2激酶的激活导致离子通道功能的调节和MAPK信号通路的激活。PYK2还在激活环内的Tyr 579和Tyr 580以及潜在Grb2结合位点上的Tyr 881处含有磷酸化位点。

PYK2抗体

PYK2抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（PYK2抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(PYK2抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

PYK2抗体可以用于酪氨酸激酶Pyk2在大鼠和小鼠卵母细胞减数分裂过程中的定位和功能研究

利用PYK2抗体蛋白质免疫印迹的方法首次检测到Pyk2和第402位酪氨酸残基磷酸化的Pyk2（Tyr402p-Pyk2）的表达。免疫荧光化学定位的研究发现,在生发泡期（GV期）的大鼠卵母细胞中Pyk2和Tyr402p-Pyk2定位于卵皮质区及细胞核周围的卵胞质中,Pyk2还存在于生发泡中。生发泡破裂（germinal vesicle breakdown,GVBD）后,Pyk2及Tyr402p-Pyk2分布在卵皮质和染色体周围的细胞质中。减数分裂后期和第二次减数分裂中期的定位相似,Pyk2和p-Pyk2分布在细胞质中和皮质区,在减数分裂纺锤体周围及其定位的皮质区有更多的Pyk2和p-Pyk2聚集。第一次减数分裂的末期,除了胞质中和皮质区的定位外,大量Pyk2和p-Pyk2集中在卵裂沟的位置。利用PYK2抗体和p-Pyk2抗体共同标记的方法研究发现,Pyk2或p-Pyk2与微丝在大鼠卵母细胞减数分裂成熟的多个阶段存在共定位现象。另外,向GV期卵母细胞中注射抗Pyk2抗体破坏了微丝的聚集并抑制了第一极体的排放,使减数分裂发生阻滞。这些结果表明Pyk2在大鼠卵母细胞成熟过程中表达,并活化,可能参与了微丝组装调节,对大鼠卵母细胞极性的确立、第一极体的排出具有重要的作用。

应用Pyk2抗体免疫荧光化学方法研究小鼠卵母细胞发现,刚从卵泡中释放出的GV期小鼠卵母细胞中,Pyk2在整个细胞质中及除核仁以外的细胞核中均匀分布,在体外培养的过程中,Pyk2逐渐向细胞核中集中,发生GVBD前,Pyk2分布在开始凝集的染色体上。GVBD后,直至整个MII期,Pyk2都均匀地分布在整个细胞质中。Tyr402p-Pyk2在刚从体内取出的GV期卵母细胞中不表达,直到体外培养1小时后才发现p-Pyk2分布在除了核仁外的整个卵母细胞中,GVBD后至第二次减数分裂中期,p-Pyk2始终均匀分布在整个细胞质中。对Pyk2在受精卵中亚细胞定位的研究发现,无论是体内受精还是体外受精,在精子穿入引发的第二次减数分裂后期,Pyk2比较均匀地分布在整个细胞质中。在排出第二极体和雄原核形成的过程中,Pyk2除了在受精卵细胞质中分布外,还与精子头部的染色体密切相关。雌雄原核融合形成合子时,Pyk2又定位在合子的细胞核中。为了进一步了解Pyk2在小鼠卵母细胞减数分裂过程中的功能,分别用Pyk2抑制剂水杨酸钠抑制Pyk2活性和抗Pyk2抗体显微注射的方法处理卵母细胞后,观察生发泡破裂和极体排放的情况。

参考文献

[1]Studies on protein tyrosine phosphorylation in mouse oocyte aturation.Kimura H.Nippon Sanka Fujinka Gakkai Zasshi.1996

[2]Fertilization signaling and protein-tyrosine kinases.Sato K,Tokmakov AA,Fukami Y.Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol.2000

[3]Knockdown of the cAMP-dependent protein kinase(PKA)Type Ialpha regulatory subunit in mouse oocytes disrupts meiotic arrest and results in meiotic spindle defects.Duncan FE;Moss SB;Williams CJ.Dev Dyn.2006

[4]An increase of intracellular free Ca2+is essential for spontaneous meiotic resumption by mouse oocytes.De Felici M,Dolci S,Siracusa G.J Exp Zool.1991

[5]孟小倩.酪氨酸激酶Pyk2在大鼠和小鼠卵母细胞减数分裂过程中的定位和功能研究[D].山东师范大学,2007.