GAD1抗体的应用

背景^[1-3]

GAD1抗体是一种在WB、IHC、IF-Fro、IP、ELISA等实验中靶向结合GAD1的免疫蛋白。谷氨酸脱羧酶1(GAD1)，也称为GAD67，是一种通过催化抑制性神经递质γ-氨基丁酸(GABA)的合成在神经传递中发挥关键作用的酶。GAD1利用吡哆醛5'-磷酸作为谷氨酸脱羧形成GABA的辅助因子，GABA是调节中枢神经系统神经元兴奋性的重要神经递质。GAD1平衡产生GABA对于维持神经回路的抑制-兴奋平衡至关重要，并且与神经系统的各种生理和病理状况有关。

GAD1抗体

GAD1抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（GAD1抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(GAD1抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

GAD1抗体可以用于SFPQ复合物及GAD1促进肠道病毒复制的机制研究

探究SFPQ/NONO复合物促进肠道病毒复制的作用机制。首先,使用SiRNA敲低SFPQ/NONO的表达,发现EV-A71病毒基因组的复制、蛋白的翻译及病毒滴度均受到了抑制,说明了SFPQ/NONO有助于EV-A71的复制。随后,通过免疫荧光共定位发现,EV-A71诱导SFPQ/NONO发生出核现象,并在细胞质形成聚集性颗粒。通过病毒复制动力学结合免疫荧光共定位发现,SFPQ/NONO感染EV-A71 2h能够观察到出核,而4h几乎均位于胞质中,且SFPQ和NONO共同存在该聚集性颗粒中。通过RNA pull down发现SFPQ/NONO与EV-A71的5'UTR的存在相互作用,且SFPQ可以促进EV-A71 5'UTR介导的翻译。

结果说明,肠道病毒的翻译依赖于感染后诱导出核的SFPQ/NONO复合物。最后,通过外源转染EV-A71的3Cpro,发现3C对SFPQ存在切割,并且3C的切割条带与病毒感染导致的切割条带一致,而当SFPQ的113位和/或257位氨基酸突变后,切割条带消失。将SFPQ野生型、切割片段与EV-A71 5'UTR-Luc共转发现,SFPQ 114-707片段的促进EV-A71的翻译作用更强。以上结果说明了肠道病毒对SFPQ的切割可以增强其辅助病毒翻译的作用。在促进病毒复制水平的宿主因子中,我们还发现谷氨酸脱羧酶1(GAD1)可以促进EV-A71、EV-D68、CV-A16和HRV16的复制。在HEK293T细胞中,经GAD1抗体检测过表达GAD1后,EV-D68的复制水平随GAD1转染量的增加而增强。将GAD1功能位点(405位赖氨酸)突变后,GAD1促进EV-D68复制的作用消失。使用GAD1的抑制剂3-巯基丙酸(3-MPA)处理可以减弱GAD1促进EV-D68复制的作用。这说明GAD1促进EV-D68复制的作用是酶活性依赖的。GAD1的产物GABA也可以促进EV-D68的复制,说明了GAD1是通过其产物GABA对EV-D68的复制起作用。

综上所述,本研究发现EV-A71感染诱导核内分子SFPQ/NONO出核形成聚集性颗粒,与EV-A71 5'UTR相互作用促进病毒RNA的翻译;EV-A71通过3Cpro对复合物中SFPQ进行了切割,切割产物增强EV-A71 5'UTR介导的翻译作用。并且神经系统高表达分子GAD1在体外具有促进肠道病毒复制的作用。

参考文献

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[5]王贯莹.SFPQ复合物及GAD1促进肠道病毒复制的机制研究[D].北京协和医学院,2023.