凝胶阻滞迁移电泳检测服务（EMSA）

背景^[1-6]

凝胶阻滞迁移电泳检测服务（EMSA）是一种研究DNA/RNA结合蛋白和其相关的DNA/RNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。依据实验需要，设计标记探针、非标记探针、蛋白特异性抗体等参照物，基于DNA-蛋白质或RNA-蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率的原理，当转录因子与特异的DNA或RNA结合后，其在PAGE中的迁移率将小于未结合核蛋白转录因子的DNA，从而检测到活化的与DNA或RNA结合的蛋白转录或调节因子。

EMSA是目前研究核酸与蛋白质相互作用的一种重要实验手段，凝胶阻滞迁移电泳检测常用于转录因子与启动子相互作用的验证性实验。该实验利用核酸与蛋白结合后，在非变性聚丙烯酰氨凝胶中电泳的迁移速率会明显降低的原理，通过设计特异性和非特异性的探针，通过孵育与目标蛋白结合，形成探针-蛋白复合体，由于分子量变大，在聚丙烯酰氨凝胶中的电泳迁移速率下降，相比于未结合的探针会出现滞后效应，再通过探针上特殊的标记物性质，通过转膜、显色或曝光，探针-蛋白复合体所在的位置便能形成条带，从而证明核酸与蛋白的相互作用。

目前随着实验技术的改进，能够定性和定量的完成实验。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前也广泛用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。

当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。反应体系中常加入随机打断的鲑鱼精DNA或polydI-dC来防止非特异性竞争；亦可以添加未标记的DNA或RNA探针，进行特异性竞争实验以确定该结合是特异性的。

应用^[7][8]

凝胶阻滞迁移电泳检测服务（EMSA）可用于蛋白分子机制研究：

在小鼠植入前胚胎中转录因子Oct4对Dnmt1启动子调控的分子机制研究中使用昆明白小鼠作为实验材料,通过定量PCR研究小鼠各植入前胚胎中Dnmt1的表达,将结果与已报导的Oct4表达水平进行比较,发现Dnmt1呈现出相反的表达模式。

通过启动子分析研究转录因子Oct4对小鼠Dnmt1启动子活性的影响,我们首先扩增出4条小鼠Dnmt1启动子5’端缺失片段,然后将缺失片段分别与pGL3-Basic载体连接形成重组质粒,将含有小鼠Oct4基因的真核表达重组质粒Oct4-pcDNA3.1与小鼠Dnmt1基因启动子5’端缺失片段-pGL3-Basic重组质粒共转染到NIH/3T3细胞系,通过检测荧光素酶活性发现,当转录起始位点上游-554-294bp区域缺失后,转录因子Oct4会抑制小鼠Dnmt1基因启动子活性。

通过免疫共沉淀及凝胶阻滞迁移实验分别在体内和体外进行研究,证实了转录因子Oct4在小鼠Dnm t1基因启动子上的结合区域。通过在NCI-H157细胞中过表达Oct4进一步说明转录因子Oct4能够促进Dnmt1的表以及增强IDNA转移酶1的活力。

研究表明,DNA甲基化、非编码RNA、组蛋白修饰、染色质重塑等都属于表观遗传修饰机制。在众多的表观遗传修饰模式中,DNA甲基化是研究的最为广泛也是最充分的表观遗传修饰模式。在胚胎发育的过程中,全基因组范围内DNA甲基化模式的改变和维持是通过DNA甲基化转移酶进行的。Oct4也是胚胎发育过程中至关重要的基因。

之前的研究表明,转录因子Oct4在小鼠植入前胚胎发育过程中起着重要的调节作用,转录因子Oct4能够结合到胚胎发育相关基因的启动子上,通过调控基因的转录及功能,从而进一步影响小鼠植入前胚胎的发育。转录因子Oct4能够影响Dnmt1的表达,从而可能进一步影响全基因组范围内的DNA甲基化模式。在哺乳动物早期胚胎发育阶段,转录因子Oct4以及其他胚胎发育相关的基因能够通过影响Dnmt1的表达,从而影响DNA甲基化模式。

参考文献

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[8]张远.小鼠植入前胚胎中转录因子Oct4对Dnmt1启动子调控的分子机制研究[D].安徽农业大学,2014.