间充质干细胞-脐带的分离培养

背景及概述^[1]

间充质干细胞(MesenchymalStemCells，MSCs)因其具有多向分化潜能和免疫调节功能，已被广泛应用于再生医学、自身免疫性疾病的临床研究之中。和造血干细胞等其他干细胞不同，MSCs是一类在体外易于扩增的干细胞。因此，虽然MSCs在体内含量极少，但可以通过体外扩增制备大量的MSCs，以满足临床使用的需要。虽然许多研究结果显示，体外扩增的MSCs用于临床试验时未见明显的毒副作用，但是我们目前对MSCs的生物学特性了解还不是十分清楚，制备供临床使用的MSCs的体外操作过程是否会对MSCs产生不利的影响也还未有定论。目前还不能说MSCs就是一种安全的细胞治疗产品，许多MSCs临床应用相关的安全性问题还值得我们去探索。对于体外扩增是否会影响MSCs的生物学特性，是否会影响其临床使用的安全性等问题，还缺少系统而全面的研究。有研究以间充质干细胞-脐带(hUC-MSCs)为研究对象，研究体外长期传代对hUC-MSCs生物学特性，包括分化潜能、致瘤性、基因组稳定性等的影响，并在食蟹猴中对体外传代的hUC-MSCs进行了体内的长期毒性分析，为评价体外扩增的hUC-MSCs作为临床使用的安全性提供必要的实验证据。

分离培养^[2]

1. 组织贴壁法：

分别取足月妊娠剖宫产健康胎儿脐带组织标本接种在49cm2培养平皿中，均匀铺放，盖上玻璃片，向培养皿中注入体积分数20%的FBS，2mmol/LL-Glu以及含体积分数1%的青链霉素的LG-DMEM培养液(美国Gibco公司)，保证脐带组织能完全浸润在培养液中，将其放置在37℃含有体积分数5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中进行孵育培养，倒置显微镜(日本Olympus公司)观察细胞形态，当见细胞自组织块周边游出、贴壁后，每隔2d换液1次。

2. 胶原酶-胰酶消化法：

分别取足月妊娠剖宫产健康胎儿脐带，将其浸泡在LG-DMEM培养液(美国Gibico公司)中，4℃保存，超净台内取出脐带用PBS(赛尔斯生物技术有限公司)充分冲洗，去除脐带中残留血，将脐带剪碎放入到0.1%胶原酶Ⅳ(美国Gibico公司)中，在温度为37℃下进行30min消化，然后向其中加入体积分数10%FBS终止消化，将获得的细胞滤液进行离心，然后加入含有LG-DMEM培养液的T-25塑料的培养瓶中，培养三四天后更换培养液，向胶原酶-组织块消化体系内加入终浓度0.1%的胰酶在37℃的环境中继续搅拌消化30min，加入体积分数10%PBS终止消化，采用细胞筛过滤，含细胞的滤液进行离心，细胞接种在LG-DMEM培养基的T-25塑料培养瓶中，培养三四天后更换培养液，去除未贴壁细胞，之后每隔3d换液1次，直到细胞充分融合传代。

3. 间充质干细胞-脐带的传代和扩增：

待细胞融合生长80%以上后，采用加入浓度为0.02%的EDTA消化，轻轻摇动培养皿，使得消化液能够覆盖全部细胞表面，除细胞培养液后再加上3-5mL消化液，在光学显微镜下观察间充质干细胞-脐带情况[20-21]。

4. 流式细胞仪检测：

取培养第3代足月妊娠剖宫产健康胎儿间充质干细胞-脐带(融合度达到80%以上)放入75cm2塑料培养瓶中培养，去除培养液，加入5mL体积分数0.2%胰酶/0.2%EDTA，显微镜下观察细胞形态，待细胞多数变成圆形后加入终止消化液，10min离心，速度1000r/min，去除上层清夜，采用锥虫蓝染色法评估细胞活性，并进行细胞计数。向细胞中加入小鼠荧光流式细胞术标记的IgG1，调整细胞容积为200mL，流式细胞仪测定结果。

5. 主要观察指标

足月妊娠剖宫产健康胎儿间充质干细胞-脐带的分离、培养组织贴壁法形态观察结果及流式细胞仪检测结果。采用SPSS18.0软件处理，计量资料采用x_±s表示，计数资料用百分率表示，组间数据差异的比较采用χ2检验和t检验，P<0.05为差异有显著性意义。

6. 结果

1）实验标本数量分析：参加60根脐带标本，60根脐带标本全部进行结果分析数量，中途无作废。

2）组织贴壁法分离、培养间充质干细胞-脐带的形态观察结果：将30例足月妊娠剖宫产健康胎儿脐带经过组织块原代培养5d后，细胞开始从脐带组织分离，

并且沿着贴壁方向呈放射状生长，形态相对单一，呈现梭形，见图2A。培养10d后细胞融合达到80%，细胞形态均一，呈长梭形，细胞核为圆形或椭圆形，位于胞体中央，见图2B。

3）胶原酶-胰酶消化法分离、培养间充质干细胞-脐带的形态观察结果：将30例足月妊娠剖宫产健康胎儿脐带经胶原酶-胰酶消化法培养5d后，可见少量形态各异的贴壁细胞分布，培养2周后培养融合达到80%，脐静脉内皮细胞生长受到明显抑制，质量浓度2.5g/L胰酶消化，传代后可见成纤维样细胞，见图3。

4）两种不同培养方法培养间充质干细胞-脐带的生长情况：比较两种不同培养方法分离出的间充质干细胞-脐带生长情况差异无有显著性意义(P>0.05)；生长曲线检测结果显示，细胞传代后前2天增殖不明显，培养3-5d后进入对数生长期，培养第5天的倍增时间为50h。

5）间充质干细胞-脐带的传代和扩增结果：间充质干细胞-脐带培养5d后能看见大量的细胞从组织块中游出，并且培养10d后融合达到80%，加入胰酶消化后根据1∶2的比例进行传代，细胞接种在培养瓶后快速生长。细胞生长起初为梭形，体积相对较小，见图4A；细胞传代第3代后，增殖趋势相对比较稳定，每隔3天传代1次，见图4B。

6）间充质干细胞-脐带表型鉴定结果显示：流式细胞仪检测显示，两组CD13，CD29，CD44及CD105表达均为阳性。

主要参考资料

[1] 间充质干细胞-脐带临床前安全性研究

[2]不同培养方法对间充质干细胞-脐带的影响