6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯的应用与有关研究

概述

6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯是一种化学式为C₁₄H₁₆N₂O₆，分子量308.2866的化学品，常温常压下为白色或者灰白色固体,具有较高的化学反应活性，对水和空气都有一定的敏感性。该物质的部分物性数据如下：密度1.404 g/cm³，沸点480.65 ℃，闪点244.49 ℃。

合成工艺

N-芴甲氧羰基-甘氨酰-甘氨酸(SM1)与四醋酸铅反应得乙酸(N-[(9H-芴-9-基)甲氧基羰基]甘氨酰基氨基)甲酯(M1)，反应溶剂革除文献的甲苯，无水四氢呋喃用量由27倍体积减为15倍体积。后处理革除柱层析，经简单的洗涤纯度96.00%以上，三批收率90.0～93.0%。M1与乙醇酸苄酯发生亲核取代反应得M2，减少乙醇酸苄酯的投料量至8eq，反应溶剂由DCM改为THF，革除柱色谱纯化，使用二氯甲烷低温析出，纯度97.00%以上。马来酰亚胺基己酸(SM2)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)缩合得6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯(M4)，革除柱层析，直接正丁醇析出，纯度98.00%以上[1]。

应用

以PEG2000为初始原料，通过与小分子的反应，将其一端羟基保留，得到NH₂-PEG2000-OH，然后将NH₂-PEG2000-OH与6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯反应，得到单端马来酰亚胺基修饰的聚乙二醇(Mal-(CH₂)₅-CONH-PEG2000-OH)。通过这条合成路线能够成功得到单端马来酰亚胺基功能化的聚乙二醇[2]。

文献公开了一种半抗原碘代甲状腺素马来酰亚胺活性偶联试剂的制备方法。具体地，将碘代甲状腺素加入到反应溶剂中，将碱性溶液与碘代甲状腺素的有机悬浮液混合，制备得到碘代甲状腺素的弱碱性溶液；将6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯溶于所述反应溶剂中并与所述碘代甲状腺素的弱碱性溶液反应，合成产品。上述制备方法具有原料价格低廉易得，合成步骤少，操作简单，提取纯化方便，收率高的优点，有利于解决小分子半抗原在制备单克隆抗体中合成人工抗原关键原料以及在开发临床检测甲功项目试剂盒中关键原料的问题[3]。

有关研究

6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯是合成维布妥昔单抗的重要原料。维布妥昔单抗(Adcetris)是由美国西雅图遗传学公司和日本武田公司联合开发的一种抗体偶联药物(ADC)。它的结构由抗肿瘤抗原CD30的特异性抗体c AC10，可断裂型二肽连接子Mc-Val-Cit-PABC-PNP，小分子毒性药物单甲基澳瑞他汀E(MMAE)组成，主要用于霍杰金淋巴瘤和系统性间变性大细胞淋巴瘤的治疗。我国研究人员通过对Adcetris结构中的连接子部分进行研究，设计与试验得到一条稳定，高收率，符合绿色化学要求，适合工业化生产的合成工艺，为后续Adcetris仿制药及具有相同连接子ADC的研发提供参考，达到降低生产成本的目标。

首先，通过比对分析连接子Mc-Val-Cit-PABC-PNP的现有合成工艺，选择出一条较优的合成路线。该路线以N-[(9H-芴-9-甲氧基)羰基]-L-缬氨酸-2,5-二氧代-1-吡咯烷基酯(Fmoc-Val-OSu)为起始原料，先与瓜氨酸发生氨解反应；在2-乙氧基-1(2H)-喹啉羧酸乙酯(EEDQ)的作用下与对氨基苯甲醇发生酰胺化反应，连接一个可自发消除的间隔基；再以二乙胺做有机碱去除缬氨酸上的Fmoc保护基；将暴露出的N端与6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯(Mc-OSu)发生氨解反应；再与二(对硝基苯)碳酸酯发生酯交换反应得目标化合物。通过单因素试验对各步反应时间，中间体纯化方式，投料量比，有机碱的使用，目标化合物合成中所使用的试剂及纯化方式等条件进行优化，使产品的纯度和收率均得到提高。接着将起始原料的投料量提高至100 g，通过放大试验对优化的合成工艺进行验证。随后，通过方法学考察验证连接子Mc-Val-Cit-PABC-PNP含量测定选择的HPLC色谱条件和方法。最后，将得到的连接子与MMAE模型化合物反应，确定连接子Mc-Val-Cit-PABC-PNP与小分子毒性药物偶联反应的条件。

通过1H NMR，13C NMR，IR和HRMS方法确证小试，放大试验得到的终产物结构为连接子Mc-Val-Cit-PABC-PNP，含量为99.2%。其中，当投料规模为100 g时合成工艺总收率稳定，可达28.3%。HPLC测定含量的方法条件为：采用C(18)色谱柱，流动相为V(乙腈):V(水)=50:50，进样体积为20μL，柱温为30℃，检测波长为254 nm。确定连接子与小分子毒性药物的偶联条件为：投料比n(Mc-Val-Cit-PABC-PNP):n(HOBt):n(小分子毒性药物):n(DIPEA)=1.0:1.0:1.1:2.0，室温反应过夜。上述以6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯等物质为原料的合成工艺避免了危化品，剧毒品的使用，与原研路线相比条件温和，操作简便，产物的纯度高并且收率稳定，适用于工业化生产。经方法学考察，以HPLC进行连接子Mc-Val-Cit-PABC-PNP含量测定的色谱条件线性关系良好，回收率，精密度，重复性实验均满足《中国药典》对采用HPLC做含量测定的要求。连接子Mc-Val-Cit-PABC-PNP与MMAE模型化合物的偶联实验得到的产物经结构确证为预期化合物，采用的连接子与小分子毒性药物的偶联条件可行。实验结果可为Adcetris仿制药的研究提供基础和依据，同时，对具有相同连接子的其它ADC的合成与研发具有促进作用[4]。

参考文献

[1]路芳芳.ADC肽类连接子的合成工艺及其与抗体和毒素的偶联[D].中国医药工业研究总院,2023.

[2]王婷,孟庆斌,王晨宏,等.单端马来酰亚胺基功能化聚乙二醇的制备[J].应用化工, 2012, 41(3):5.DOI:10.3969/j.issn.1671-3206.2012.03.020.

[3]张冬冬,陈梁.一种半抗原碘代甲状腺素马来酰亚胺活性偶联试剂的制备方法:CN202110855626.0[P].CN202110855626.0.

[4]杨柳.抗体偶联药物连接子Mc-Val-Cit-PABC-PNP的合成与优化[D].长春中医药大学,2023.