小牛胸腺DNA的应用

背景^[1-6]

小牛胸腺DNA（CT-DNA)是一种天然的DNA广泛用于研究DNA绑定抗癌剂和DNA绑定代理,调节DNA结构和功能。

小牛胸腺DNA细胞生物学研究有以下几个方面：

细胞生物学的研究内容十分广泛,主要包括：①细胞核、染色体以及基因表达的研究；②生物膜与细胞器的研究；③细胞骨架体系的研究；④细胞增殖及其调控；⑤细胞分化及其调控；⑥细胞的衰老与编程性死亡(凋亡)；⑦细胞的起源与进化；⑧细胞工程。

制备方法：

1.取新鲜（或冰冻）的小牛胸腺，除去血水和结缔组织，在冰浴上切成小块，称取 20g，加入2倍体积的0.1mol/L氯化钠-0.05mol/L，pH=7.0柠檬酸钠缓冲溶液，于组织捣碎机上高速匀浆5分钟。

2.组织糜用转速为;3000r/min的离心机离心15分钟，将沉淀用50 mL上述缓冲溶液洗涤2次，洗涤时用匀浆器研磨洗涤，每次如前离心。

3.向后得到的细胞核沉淀中加入6倍体积的10%氯化钠溶液，充分搅匀置冰箱中过夜，以充分提取DNP，溶液为粘稠状。

4将所得的半透明粘稠状液体，用滴管慢慢注入冷蒸馏水中，边加边轻轻搅动（NaCl的终浓度为0.14mol/L），这时有白色丝状物——核蛋白析出，在冰箱中静置数小时，收集沉淀。

5.将沉淀物再溶于4倍体积的10%氯化钠溶液中，迅速搅拌以加速溶解。加入1/2体积的氯仿-异戊醇混合液，剧烈振荡5分钟左右，用转速为3000r/min的离心机离心15分钟，得三层：上层为含有DNA和DNA核蛋白的水层，下层为氯仿-异戊醇的有机溶剂层，变性蛋白质介于两层之间。

6.吸出上面的水层，再用氯仿-异戊醇如前进行脱蛋白，直至界面处不再出现变性蛋白质为止。

7.后吸出上清液并将其注入两倍体积的95%乙醇中，用玻璃棒搅起白色纤维状DNA沉淀，沥干，用80%乙醇洗涤，后用少量无水乙醇洗涤。尽量沥干乙醇后，铺开在表面皿上。置于真空干燥器内干燥，即得白色纤维DNA钠盐。DNA在生物体内是以与蛋白质形成复合物的形式存在的，因此提取出脱氧核糖核酸蛋白复合物（DNP）后，必须将其中的蛋白质除去。

小牛胸腺，鱼类精子和植物种子的胚等含有丰富的DNA，可作为提取DNA的良好材料。动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白可溶于水或浓盐溶液（如1mol/L氯化钠溶液），但在0.14mol/L盐溶液中的溶解度很低，而核糖核蛋白（RNP）则溶于0.14mol/L盐溶液中，利用这一性质可将脱氧核糖核蛋白与核糖核蛋白以及其他杂质分开，当核蛋白与氯仿一起振荡时，蛋白质变性而与核酸分开，核酸继续保留于水相中，再用乙醇将水相中的DNA沉淀出来。为除去DNA制品混杂的RNA，可用核糖核酸酶处理。大部分多糖在用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去，如需要还可以进一步通过柱层析或电泳加以纯化。

应用^[7][8]

小牛胸腺DNA可用于药物与DNA相互作用的光谱学研究：

在卟啉化合物的聚集及其与DNA相互作用的光谱学研究中以meso-位具有不同侧链的卟啉化合物四-[3-甲氧基-4-(N-咔唑)正丁氧苯基]卟啉(4C4-TPP)和四-[3-甲氧基-4-(N-咔唑)正己氧苯基]卟啉(4C6-TPP)为研究对象,利用吸收光谱、荧光光谱、圆二色谱和拉曼光谱探讨卟啉侧链基团在聚集体形成、聚集体结构及其与DNA结合中所起的作用。

在一定浓度范围内,4C4-TPP和4C6-TPP在有机溶剂四氢呋喃中以单体分子存在,溶于水-四氢呋喃混合溶剂中卟啉分子趋于聚集。特定水-四氢呋喃(tetrahydrofuran,THF)体积比中4C6-TPP以典型的自组装动力学而聚集。4C6-TPP,THF和水三者相互作用形成笼状结构,4C6-TPP分子处于笼中,侧链苯基团与中心环的共轭程度增加,聚集体整体结构对称,圆二色信号消失。增加水-四氢呋喃混合溶剂中的离子强度诱导4C6-TPP聚集。

降低pH值,导致4C6-TPP质子化进而聚集。以四苯基卟啉和咔唑基团为模型化合物深入研究质子化诱导4C6-TPP聚集的机理,并提出质子化4C6-TPP聚集体的结构模型:借助于外加酸根阴离子,卟啉中心环与侧链之间以非共价键作用,分子间规则排列形成J-聚集体。

4C4-TPP和4C6-TPP侧链插入小牛胸腺DNA(calf thymus DNA,ctDNA),4C4-TPP与ctDNA的作用不涉及复杂的过程,但是4C6-TPP与ctDNA以负协同模式分两步相互作用,其结合常数远大于4C4-TPP与ctDNA的结合常数。4C4-TPP和4C6-TPP在聚集及其与ctDNA作用中的差异有力的证明了卟啉侧链不仅是形成聚集体结构的关键因素,还影响其与DNA的作用。

参考文献

[1]Effect of N-alkyl substituents on the DNA binding properties of meso-tetrakis(4-N-alkylpyridinium-4-yl)porphyrins and their nickel derivatives.Gray TA,Yue KT,Marzilli LG.Journal of Inorganic Biochemistry.1991

[2]Self-assembly of oligomeric porphyrin rings.Haycock RA,Hunter CA,James DA,et al.Organic Letters.2000

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[4]Energy transfer followed by electron transfer in a supramolecular triad composed of boron dipyrrin,zinc porphyrin,and fullerene:A model for the photosynthetic antenna-reaction center complex.D‘Souza F,Smith PM,Zandler ME,et al.Journal of the American Chemical Society.2004

[5]Self-assembly of a tetrapeptide in which a unique supramolecular helical structure is formed via intermolecular hydrogen bonding in the solid state.Maji SK,Banerjee A,Drew MGB,et al.Tetrahedron Letters.2002

[6]The Self-Assembly of an Unexpected,Unique Supramolecular Triangle Composed of Rigid Subunits.Schweiger M,Seidel SR,Arif AM,Stang PJ.Angewandte Chemie International Edition.2001

[7]Supramolecular self-assembly of porphyrin-fluorescein hybrid with amino-porphyrinatocopper(II)and its fluorescence strengthening character.Lu JZ,Huang JW,Fan LF,L et al.Inorganic Chemistry.2004

[8]王雪丽.卟啉化合物的聚集及其与DNA相互作用的光谱学研究[D].吉林大学,2008.