小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞的纯化和培养

背景及概述^[1]

小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞分离自肺组织；小肺泡细胞，又称I型肺泡细胞，厚约0.1微米，基底部是基底膜，无增殖能力。大肺泡细胞，又称Ⅱ型肺泡细胞，分泌表面活性物质（二棕榈酰卵磷脂），以降低肺泡表面张力。Ⅱ型肺泡细胞位于Ⅰ型肺泡细胞之间，数量较Ⅰ型肺泡细胞多，但覆盖面积比Ⅰ型肺泡细胞小。细胞立方形或圆形，顶端突入肺泡腔。细胞核圆形，胞质着色浅、呈泡沫状。电镜下，细胞游离而有少量微绒毛，胞质内富含线粒体和溶酶体，有较发达的粗面内质网和高尔基复合体。核上方有较多的分泌颗粒，电子密度高、大小不等，直径约0.1-1.0μm颗粒内含有平行排列的板层状结构，称为嗜饿性板层小体。小体内的主要成分为磷脂，以二棕榈酰卵磷脂为主，此外还有糖胺多糖及蛋白质等。小鼠Ⅱ型肺泡细胞有分裂、增殖并分化为Ⅰ型肺泡细胞的潜能，故具有修复受损伤上皮的作用。

纯化和培养^[2]

①免疫黏附法纯化小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞：将肺组织细胞悬液按3×106有核细胞/ml接种入小鼠IgG包被平皿，37℃5%CO2培养箱培养，置37℃、5%CO2培养箱内孵育2～2.5h；吸取未黏附的细胞，800r/min离心4min，收集细胞；

②小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞的培养：DMEM/F12完全培养基悬浮纯化的细胞，调节细胞浓度至1×106个/ml，并按4×105个/cm2密度接种于Ⅰ型Collagen包被的平皿中；37℃、5%CO2培养箱内培养24h，换液去除未贴壁细胞，继续培养3～5d。光镜观察细胞生长状态和形态特征。

结果显示：每只小鼠肺组织经酶消化分离、纯化贴壁后平均可获Ⅱ型肺泡上皮细胞(4.5±1.8)×106(n=5)，纯度高达(80±2.6)%(n=5)，锥虫蓝拒染实验检测接种细胞的活力为(95±3)%(n=5)。此外，还有少量巨噬细胞、成纤维细胞等。小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞体外培养12～18h伸展贴壁，细胞呈圆形或立方形，细胞质内有大量细小颗粒，细胞呈岛状生长。大约48h后细胞逐渐变得扁平，细胞内颗粒减少。光镜下难以分辨出少的Clara细胞。分离纯化的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞形态较规则，细胞质较多，细胞核明显，细胞质内含较多大小不一的、洋葱样结构的嗜锇小体即板层体。

相关研究^[3]

有研究观察布地奈德(BUD)、卡介苗(BCG)干预对支气管哮喘小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(ATⅡ)损伤的影响。方法昆明小鼠40只随机分为哮喘模型组、BUD干预组、BCG干预组和正常对照组。以卵白蛋白致敏和激发复制小鼠哮喘模型，并行BUD、BCG干预。HE染色观察其呼吸道周围嗜酸性粒细胞(EOS)浸润。ELISA法检测其血清、支气管肺泡灌洗液(BALF)中Krebsvondenlungen-6(KL-6)表达及BALF中IL-4、IFN-γ表达。免疫组织化学染色(SABC法)观察其肺表面活性蛋白(SP-A、SP-B)的表达。透射电镜观察其ATⅡ形态。

结果哮喘模型组、BUD干预组、BCG干预组、正常对照组EOS分别为(806±91)个.mm-2、(173±25)个.mm-2、(189±19)个.mm-2及(3±1)个.mm-2；血清KL-6水平分别为(1.514±0.027)ng.L-1、(1.101±0.020)ng.L-1、(1.008±0.019)ng.L-1及(0.753±0.033)ng.L-1；BALF中KL-6水平分别为(0.842±0.020)ng.L-1、(0.268±0.024)ng.L-1、(0.243±0.026)ng.L-1及(0.090±0.015)ng.L-1；BALFIL-4水平分别为(22.61±2.35)ng.L-1、(13.34±2.41)ng.L-1、(15.56±3.08)ng.L-1及(0.62±0.15)ng.L-1；BALFIFN-γ水平分别为(40.56±3.58)ng.L-1、(60.37±6.41)ng.L-1、(57.87±6.28)ng.L-1及(75.64±6.09)ng.L-1；SP-AIOD值分别为45.89±10.08、181.34±29.41、200.12±32.08及389.62±45.05；SP-BIOD值分别为10.34±2.42、88.76±12.66、87.13±14.58及187.89±27.15。

上述指标除BUD干预组与BCG干预组之间差异无统计学意义外，余各组间差异均有统计学意义(Pa<0.01)。电镜下可见哮喘模型组小鼠ATⅡ板层小体和线粒体减少，有明显排空和空泡化改变，部分细胞变性、坏死。干预后上述改变均有明显改善。哮喘模型组、BUD干预组及BCG干预组BALF中KL-6水平与EOS呈明显正相关，与BALF中IL-4/IFN-γ亦呈明显正相关。SP-A与BALFIL-4/IFN-γ呈明显负相关。结论支气管哮喘使小鼠ATⅡ明显受损，KL-6表达增加，SP-A、SP-B表达下降。BUD、BCG干预可减轻哮喘ATⅡ的损伤。

主要参考资料

[1] 儿科学辞典

[2] 小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离、培养和鉴定

[3] 布地奈德、卡介苗干预对支气管哮喘小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤的影响