细胞毒性T细胞扩增试剂盒的使用方法

背景及概述^[1]

肝病与肿瘤，在我国均属于高发疾病。肿瘤特异性免疫治疗的研究持续发展过程中，其中细胞毒性T淋巴细胞因对某些病毒、肿瘤细胞等抗原物质具有杀伤作用而被研究者们发现。细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)，亦叫TC细胞(cytotoxic T cell)，是白细胞的亚群，为一种特异T细胞，专门分泌各种细胞因子参与免疫作用。与自然杀伤细胞构成机体抗病毒、抗肿瘤免疫的重要防线。Helmich等人的研究表明，CTL无论在体外，还是在体内正常生理状态下，都能够对表达与其TCR匹配的抗原的肿瘤有明显的杀伤效果。

使用方法^[1]

体外高效扩增培养细胞毒性T淋巴细胞的方法具体步骤为：

步骤一：配置培养基，每1mL X-VIVO 15无血清培养基内含IL-21000IU，包被培养瓶，用50g/mL CD3预处理T225cm²带有空气滤膜的细胞培养瓶，4℃包被过夜后，备用；

步骤二：取样，取100mL静脉血，其中活率≥90％，用于制备单个核细胞，取等量淋巴细胞分离液，小心转移静脉血至分离液之上，轻柔操作避免打破交界液面，采用离心机进行离心，在1800×rpm离心15min，小心吸取中间白膜层，即单个核细胞层，转移至新离心管中；

步骤三：单个核细胞用生理盐水浸泡，采用离心机进行离心在1800×rpm，离心10min，充分漂洗3遍；

步骤四：将分离获得的单个核细胞用一定体积的X-VIVO 15无血清培养基培养，无血清培养基培养中内含IL-2，终浓度1000IU/mL，按1-2.0×10⁶个/mL的浓度接种于包被过的T225cm²细胞培养瓶中，细胞培养瓶中内含CD3，终浓度50g/mL，放置在37℃下，在5％±0.5％CO²的饱和湿度的培养箱内培养；

步骤五：第4天向T225cm²细胞培养瓶中补入步骤二中等体积X-VIVO 15无血清培养基，无血清培养基内含IL-2，终浓度1000IU/mL，做好标记，放入CO₂培养箱中继续培养；

步骤六：第6天，观察培养基颜色并计数，向T225cm²细胞培养瓶中补入150mL 37℃预热的X-VIVO 15无血清培养基，无血清培养基内含IL-2，终浓度1000IU/mL，混匀，放入CO₂培养箱中继续培养；

步骤七：第7天扩增培养，培养瓶内细胞处于1.0×10⁶个/mL左右时最适宜进行扩增操作，数量过低应将培养瓶放回培养箱，继续培养，取出细胞培养瓶，表面消毒，放入生物安全柜中，用移液器轻轻吹打细胞，混匀，均分至5个T225cm²细胞培养瓶中，每瓶补足37℃预热的X-VIVO 15无血清培养基，无血清培养基内含IL-2，终浓度1000IU/mL，至200mL，混匀，放入CO₂培养箱中培养；

步骤八：第13天向5个细胞培养瓶中补入37℃预热的X-VIVO 15无血清培养基，无血清培养基内含IL-2，终浓度1000IU/mL，至200mL，混匀，放入CO₂培养箱中培养；

步骤九：第20天收获细胞，收集5瓶细胞培养物，在室温下，采用离心机在1500rpm下，离心10min；

步骤十：计数，取少量细胞，稀释至200倍，可收获细胞数量约为3-4×10⁹个；

步骤十一：利用流式细胞术检测CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD25+细胞比例，此类细胞为细胞毒性T淋巴细胞，利用无血清冻存液冻存该细胞于液氮中。

主要参考资料

[1] CN201811454732.2 一种体外高效扩增培养细胞毒性T淋巴细胞的方法