Pull Down实验服务

背景^[1-7]

Pull Down实验服务是在体外条件下检测蛋白质间相互作用的方法。通过SDS-page电泳分析，或结合WB和MS检测，可验证蛋白间的相互作用或筛选获取相应的目的蛋白。GST-pull-down是体外验证/寻找互作蛋白的技术，大多采用标签（如GST）抗体来检测，因此适用范围广。Pull-down技术与Co-IP非常相似，只不过后者是用抗体交联磁珠或agarose，pull-down是用固相化的、已标记的饵蛋白或标签蛋白（生物素-、PolyHis-或GST-），从细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白（对混合液中的所有蛋白）。

通过Pull-down技术可以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系，从体外转录或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。联用高分辨率质谱对pull-down拉下来的蛋白复合物进行进一步鉴定，就能检测出与靶蛋白相互作用的蛋白质。在Pull down实验中，带有标签的诱饵蛋白被特异结合该标签的固相化亲和配基捕获，产生“次级亲和支持物”，用于纯化与诱饵蛋白相互作用的其他蛋白。

固相化诱饵蛋白的次级亲和支持物可以与含有推测猎物蛋白的各种蛋白样品相互孵育，如果缓冲液及样品条件与靶结合相互作用兼容，且诱饵蛋白在带有标签和被固相化时仍然可以行使功能，那么存在于样品中的猎物蛋白就会结合到亲和支持物上，“诱饵-猎物复合体”可从支持物上洗脱下来。

服务流程：

1.构建带标签的诱饵蛋白原核表达载体（带his或GST标签）；

2.载体转化大肠杆菌，表达诱饵蛋白（这一步比较关键，很多蛋白原核表达会形成包涵体，极大影响后续实验，我们采用自诱导培养基培养细菌，使得包涵体形成的几率大大降低）；

3.细菌裂解液过柱子，带标签的诱饵蛋白被特异结合标签的固相化亲和配基捕获，产生“次级亲和支持物”；

4.待测样品裂解液过柱子孵育，与诱饵蛋白互作的蛋白被“次级亲和支持物”吸附；

5.清洗，离心，去除未结合的杂蛋白；

6.洗脱，得到诱饵蛋白及其互作蛋白的复合物；

7.如要验证某个蛋白X与诱饵蛋白互作，则将6.所得的蛋白复合物与X蛋白的抗体孵育，做Western blot验证；

8.如要寻找诱饵蛋白可能的互作蛋白，则将6.所得的蛋白复合物进行LC-MS/MS鉴定；

应用^[8][9]

Pull Down实验服务可用于筛查PAD4相互作用蛋白：

PAD4也可以作为共抑制因子下调抗癌基因P53诱导的下游基因的表达，被认为参与了肿瘤的发生，但具体作用机制尚不清楚；PAD4主要在免疫细胞中表达，是五种肽酰基精氨酸脱亚胺酶中唯一具有核定位信号的蛋白多肽瓜氨酸化酶。实验室通过蛋白免疫印迹发现TNF-α有诱导HL-60细胞中PAD4蛋白核转移现象，PAD4蛋白核转移后分子量变大，推测入核过程中可能与其他蛋白发生相互作用。

明确其核转移时相互作用蛋白及阐明其核转运机制，对于认识PAD4在正常生理状态和病变情况下的基因功能具有重要的意义。构建GST-PAD4载体及核定位信号缺失载体GST-PAD4-NLS-，通过优化表达条件得到高纯度融合蛋白GST-PAD4及GST-PAD4-NLS-，用GST pull-down assay初步寻找PAD4核转移时与之相互作用的蛋白。

方法：用TNF-α处理HL-60细胞，蛋白免疫印迹观察PAD4在HL-60细胞中核转移，然后构建带有GST标签的PAD4以及PAD4核定位信号缺失（PAD4-NLS-）的原核表达载体；通过转化大肠杆菌BL21菌株，获得重组蛋白表达的工程菌，经过优化诱导表达条件，获得重组蛋白的可溶性表达；再利用Sepharose4B亲和层析法分别纯化出重组蛋白GST-PAD4以及GST-PAD4-NLS-，将纯化的重组蛋白分别固定在谷胱甘肽琼脂糖凝胶(Sepharose4B)上，与来源于HL-60细胞中的总蛋白共同孵育，富集可能与GST-PAD4以及GST-PAD4-NLS-发生相互作用的蛋白；最后经SDS-PAGE联合银染初步寻找可能与PAD4或PAD4-NLS-发生相互作用的蛋白。

参考文献

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