免疫共沉淀检测服务

背景^[1-7]

免疫共沉淀检测服务是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的，用于研究蛋白质相互作用的基本方法。原理是以细胞内源性靶蛋白为诱饵，将靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行共孵育，促进免疫复合物的形成。随后加入能够与靶蛋白抗体结合的protein A/G，形成“结合蛋白-靶蛋白-靶蛋白抗体”复合物。免疫复合物经纯化后进行凝胶电泳分离，结合Western blot或质谱技术，进而达到纯化目的蛋白质、定性检测抗原或抗体的目的。

与其它研究方法相比，免疫共沉淀在生理条件下检测蛋白质之间的相互作用，因此，不仅可以检测到体内形成的天然复合体，而且可排除过表达靶蛋白所带来的假阳性。其次内源性的靶蛋白质是完全加工、修饰和成熟的蛋白质，因此，依赖于修饰的蛋白质相互作用也能被检测到。染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具，利用该技术不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰以及转录因子与基因表达的关系。免疫共沉淀（Co-IP）是以研究蛋白质相互作用的经典方法，其原理基础为抗体-抗原之间的专一性作用。

在分子病理生物学研究领域，Co-IP是用以确定两种蛋白在完整细胞内生理性相互作用的常用方法。其技术原理为：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来，如果用蛋白质N的抗体免疫沉淀N，那么与N在体内结合的蛋白质M也能沉淀下来。目前多用于精制的蛋白A预先结合固化在琼脂糖的珠子（Beads）上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的蛋白A就能吸附抗原到精制的目的。Co-IP主要用于测定两种目标蛋白质在体内的结合情况，也用于确定一种特定蛋白质的新的结合蛋白。

染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化及鉴定。

服务内容

1.标签蛋白的免疫共沉淀(Myc-tag,Flag-tag,HA-tag)

2.非标签蛋白的免疫共沉淀(Native protein)

3.染色质免疫共沉淀（Chip-IP）

技术流程

1.构建相关真核表达载体，转染细胞并获得表达；

2.蛋白质抽提与定量；

3.免疫沉淀（以normal IgG作为对照）；

4.免疫沉淀产物SDS-PAGE和western blot分析；

5.完整技术服务实验报告提交。

应用^[8]

免疫共沉淀检测服务可用于筛选研究蛋白之间的相互作用：

筛选细胞内与A型流感病毒M2蛋白(A/M2)相互作用的蛋白质。将A/M2编码序列插入真核表达载体pCAGGS-CFlag,重组质粒pCAGGS-CFlag-A/M2转染HEK-293T细胞,裂解细胞,以Flag单抗偶联的琼脂糖球珠免疫沉淀A/M2-Flag蛋白,清洗去除非特异性结合的杂蛋白后,SDS-PAGE银染法显示与A/M2共沉淀的蛋白,从胶上切下此蛋白条带进行质谱分析。

构建了A/M2的表达质粒,免疫印迹证实了A/M2蛋白在293T细胞中能够表达,免疫共沉淀筛选到与A/M2结合的多种蛋白,分析质谱结果,确定ataxin 10和3个真核翻译起始因子(eIF)为候选蛋白。ataxin 10与A/M2相互作用为流感病毒感染或接种流感疫苗引发小脑性共济失调提供了解释,eIF与A/M2相互作用表明A/M2可能在调控病毒蛋白合成方面起重要作用。

参考文献

[1]Ataxin-10,the spinocerebellar ataxia type10neurodegenerative disorder protein,is essential for survival of cerebellar neurons.Marz P,,Probst A,Lang S,et al.the Journal ofBiological Chemistry.2004

[2]Influenza virus M2 protein is an integral membrane protein expressed on the infected-cell surface.Lamb RA,Zebedee SL,Richardson CD.Cell.1985

[3]Sequences of mRNAs derived from genome RNA segment 7 of influenza virus:colinear and interrupted mRNAs code for overlapping proteins.Lamb,R.A.,Lai,C.-J.,Choppin,P.W.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.1981

[4]Structural characteristics of the M2 protein of influenza A viruses:evidence that it forms a tetrameric channel.Sugrue RJ,Hay AJ.Journal of Virology.1991

[5]Influenza virus M2 integral membrane protein is a homotetramer stabilized by formation of disulfide bond.Holsinger L J,Lamb R A.Journal of Virology.1991

[6]Structural basis for the function and inhibition of an influenza virus proton channel.Stouffer A L,Acharya R,Salom D,Levine A S,CostanzoL D,Soto C S,Tereshko V,Nanda V,Stayrook S,DeGrado W F.Nature.2008

[7]Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus.Schnell JR,Chou JJ.Nature.2008

[8]李耀东,关振宏,严景华.免疫共沉淀筛选细胞内与A型流感病毒M2蛋白相互作用的蛋白[J].微生物学报,2009,49(08):1081-1085.