IMR-90人胚肺成纤维细胞的应用

背景^[1-3]

IMR-90人胚肺成纤维细胞是一种广泛应用于生物学和医学研究的细胞模型。这些细胞源自16周龄女性胎儿的正常肺组织，具有特定的生物学特性，如能够合成和分泌大量的细胞外基质成分，如胶原蛋白、弹性蛋白和纤维连接蛋白等。这些特性使得IMR-90人胚肺成纤维细胞成为研究肺部细胞外基质重塑过程的重要工具，对于肺部疾病的治疗和预防具有重要意义。

在细胞培养方面，IMR-90细胞系在细胞衰老前可以达到约58次的群体倍增。它们在体外以成纤维状形态贴壁生长，表现出许多已分化平滑肌细胞的特征，如肌动蛋白附着位点呈显著规则的纵向排列。此外，这些细胞对多种病毒具有敏感性，包括人类脊髓灰质炎病毒1型、2型和3型，水痘-带状疱疹病毒，单纯疱疹病毒1型和2型，牛痘病毒，人类疱疹病毒5型，以及水泡性口炎病毒。

IMR-90细胞的培养条件包括MEM基础培养基、10-20%FBS、1%非必需氨基酸和1%双抗。培养环境为温度37°C、气相95%空气和5%CO2、湿度70-80%。传代密度为70-80%，比例为1:2-1:8，换液周期为每2-3天。冻存液配方为90%完全培养基和10%DMSO，冻存后的细胞可以在液氮中长期保存。

IMR-90人胚肺成纤维细胞

IMR-90人胚肺成纤维细胞培养操作

1)复苏IMR-90人胚肺成纤维细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)IMR-90人胚肺成纤维细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)IMR-90人胚肺成纤维细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

IMR-90人胚肺成纤维细胞可以用于EGF诱导人胚肺成纤维细胞衰老的机制研究

研究发现EGF能够诱导IMR-90人胚肺成纤维细胞发生衰老,所以本课题主要对EGF诱导IMR90细胞衰老的机制进行了探究。

研究方法与结果:在本研究中,我们发现EGF能够诱导IMR-90人胚肺成纤维细胞发生衰老。首先,细胞生长曲线和Brd U掺入实验证明了EGF处理抑制了IMR90细胞的生长。通过观察,发现经EGF处理的细胞呈现出衰老细胞的表征,SA-β-gal染色和DAPI染色的结果表明EGF诱导IMR90细胞发生了衰老。在此基础上,免疫荧光和免疫印迹技术的检测结果显示,53BP1凝集点形成,γH2A.X和53BP1蛋白水平上调,表明EGF处理引发了DNA损伤反应;p38、p-p38、p53、p-p53、p21和p16蛋白水平上调,表明EGF激活了衰老相关信号通路。在探究EGF诱导IMR90细胞衰老的机制的过程中,Ras-GTP assay和免疫印迹的结果表明EGF刺激之后,细胞内的Ras-GTP、p-ERK1/2蛋白水平上调,EGF激活了细胞内的Ras信号通路;利用慢病毒敲减BRaf抑制了EGF引起的细胞衰老。

因此,推测EGF是通过激活Ras-Raf-MEK-ERK通路诱导IMR-90人胚肺成纤维细胞发生衰老的。此外,还发现EGF诱导IMR-90人胚肺成纤维细胞衰老与细胞周期相关,处于G2/M期的细胞更容易被EGF诱导发生衰老。研究结论与意义:综合以上研究内容,发现EGF通过激活EGFR下游的Ras信号通路,引起细胞内DNA损伤反应和衰老相关信号通路的激活,导致IMR90细胞的衰老。这些研究成果丰富了人们对EGF生物学功能的认知,有助于推动EGF诱导细胞衰老的机制的研究。

参考文献

[1]The Epidermal Growth Factor Receptor:Structure-Function Informing the Design of Anticancer Therapeutics[J].Ruth A Mitchell;;Rodney B Luwor;;Antony W Burgess.Experimental Cell Research,2018

[2]Senescence and Cancer[J].Sulin Zeng;;Wen Shen;;Li Liu.Cancer Translational Medicine,2018(3)

[3]MEK inhibitors in oncology:a patent review(2015-Present)[J].Mahapatra;;Asati;;Bharti.Expert Opinion on Therapeutic Patents,2017(8)

[4]Baicalein increases cisplatin sensitivity of A549 lung adenocarcinoma cells via PI3K/Akt/NF-κB pathway[J].Meiling Yu;;Benquan Qi;;Wu Xiaoxiang;;Jian Xu;;Xiaolin Liu.Biomedicine&Pharmacotherapy,2017

[5]沈明香.EGF诱导人胚肺成纤维细胞衰老的机制研究[D].江苏大学,2019.