人肝星形细胞的应用

背景^[1-3]

人肝星形细胞是肝脏中的一种特有非实质细胞，它们在肝脏中起着重要的作用。正常情况下，人肝星形细胞主要存在于Disse腔中，呈梭形或多边形，胞浆内含有多个富含维生素A的脂滴。在静息状态下，它们不表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），增殖活性低，合成胶原能力也低。但当肝脏受到炎症或机械刺激等损伤时，这些细胞会发生增殖活化，转变为肌成纤维细胞样细胞（MFC），表现出明显的细胞增殖、收缩性增加、大量表达α-SMA等特点。

人肝星形细胞在肝纤维化过程中扮演着重要角色。它们不仅是细胞外基质（ECM）的主要来源，而且当被激活时，会通过增生和分泌细胞外基质参与肝纤维化的形成和肝内结构的重建。此外，它们还能通过细胞收缩使肝窦内压升高。在正常肝脏中，人肝星形细胞的功能主要包括代谢和贮存维生素A、储存脂肪、合成和分泌胶原及糖蛋白、蛋白多糖等基质成分，以及合成基质金属蛋白酶及其组织抑制剂，维持肝脏ECM的合成和分解处于动态平衡中。

LX-2细胞是一种永生化的人肝星形细胞系，通过用SV40大T抗原转染原代人肝星状细胞并选择性培养早期传代细胞而产生。LX-2细胞保留了重要的细胞因子信号传导、神经元基因表达、视黄醇代谢和纤维化形成的关键特征，广泛应用于研究肝脏疾病，特别是纤维化的发病机制和抗纤维化药物的评估。这些细胞在低血清条件下也能生长，并表达多种与肝纤维化相关的标志物，如α-SMA、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和I型胶原。

人肝星形细胞

人肝星形细胞培养操作

1)复苏人肝星形细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)人肝星形细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)人肝星形细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

人肝星形细胞可以用于细胞自噬在肝星形细胞纤维化中的作用原发性胆汁性胆管炎血脂异常特点

探讨细胞自噬、TGF-β1与人肝星形细胞系LX-2纤维化之间的关系。

研究方法LX-2经含10%FBS的DMEM完全培养基培养并传代,经不同处理方法培养:(1)DMEM完全培养基与人肝星形细胞LX-2共培养48小时(h),收集0h、1h、3h、6h、9h、12h、24h、36h、48hLX-2。

(2) 加入TGF-β1至终浓度为10 ng/ml与LX-2人肝星形细胞共培养48h,收集0h、1h、3h、6h、9h、12h、24h、36h、48hLX-2。

(3) 加入TGF-β1至终浓度为10 ng/ml与人肝星形细胞LX-2共培养48h,分别在20h加自噬抑制剂巴弗洛霉素A1(bafilomycinAl,BA1)至终浓度为3nmol/L、10nmol/L,氯喹(Chloroquine,CQ)至终浓度为10umol/L、30umol/L,3-甲基嘌呤(3-methyladenine,3-MA)至终浓度为300umol/L、1000umol/L,于48h收集LX-2。

(4) DMEM完全培养基中与人肝星形细胞LX-2共培养48h,分别在20h加BA1至终浓度为10 nmol/L,CQ至终浓度为30 umol/L,于48h收集LX-2。

(5) 加入TGF-β1至终浓度为10 ng/ml与人肝星形细胞LX-2共培养48h,在20 h将DMEM完全培养基换成平衡盐溶液饥饿LX-2激活自噬4 h,此时收取LX-2细胞蛋白样品,同时换成完全培养基继续培养至TGF4 1加入后的48h,收取蛋白样品检测。

(6) Western Blotting方法检测其不同处理组微管相关蛋白轻链3 B-II(Microtubule-associated protein light chain 3,LC3)、纤维连接蛋白(Fibronectin)和alpha-SMA的蛋白表达量。(7)RT-PCR方法检测各组Fibronectin和alpha-SMA基因的相对表达量。

结果(1)人肝星形细胞LX-2在基础状态下有低水平自噬,随着培养时间延长越明显,而Fibronectin和alpha-SMA蛋白表达量无明显变化。(2)TGF-β1刺激后LX-2人肝星形细胞自噬在3h开始出现,24h开始达峰,48小时减弱;Fibronectin和alpha-SMA的蛋白表达量随时间延长逐渐增多,48h增多明显。(3)TGF-β1刺激并抑制自噬后高浓度BA1和CQ组LC3B-II蛋白表达量增力口,加入自噬早期抑制剂3-MA后LC3B-II蛋白含量明显减少,Fibronectin和alpha-SMA的蛋白表达量随着自噬抑制而增加。(4)正常培养条件下抑制自噬后LC3B-II蛋白表达量增加,Fibronectin和alpha-SMA的蛋白表达量随着自噬抑制而增加。(5)TGF-β1刺激后,饥饿诱导自噬LC3B-II蛋白含量明显增加,Fibronectin和alpha-SMA蛋白的表达量随着自噬激活而减少。(6)TGF-β1刺激组较基础状态组Fibronectin和alpha-SMA基因相对表达量明显升高,差异有统计学意义,(p<0.01);TGF-β1+BA1组、TGF-β1+CQ组和TGF-β1+3-MA组、TGF-β1+饥饿组与TGF-β1组相比Fibronectin和alpha-SMA基因相对表达量明显无明显差异。

结论:LX-2人肝星形细胞在基础状态下有低水平自噬而无明显纤维化;TGF-β1可激活LX-2发生自噬并促进纤维化;在TGF-β1刺激条件下抑制LX-2自噬可促进纤维化,激活自噬可抑制纤维化。

参考文献

[1]Risk of cerebrovascular accident in patients with primary biliary cirrhosis:a systematic review and meta-analysis[J].Patompong Ungprasert;;Karn Wijarnpreecha;;Charat Thongprayoon.European Journal of Gastroenterology&Hepatology,2016(1)

[2]Macrophage autophagy protects against liver fibrosis in mice[J].Jasper Lodder;;TimothéDena?s;;Marie-No?le Chobert;;JingHong Wan;;Jamel El-Benna;;Jean-Michel Pawlotsky;;Sophie Lotersztajn;;Fatima Teixeira-Clerc.Autophagy,2015(8)

[3]A novel histone deacetylase 6‐selective inhibitor suppresses synovial inflammation and joint destruction in a collagen antibody‐induced arthritis mouse model[J].Jaejoon Lee;;Eun Chung Hong;;Hyemin Jeong;;Ji Won Hwang;;Hyungjin Kim;;Eun‐Kyung Bae;;Joong Kyong Ahn;;Yoon‐La Choi;;Jungho Han;;Hoon‐Suk Cha;;Eun‐Mi Koh.Int J Rheum Dis,2015(5)

[4]Differential use of autophagy by primary dendritic cells specialized in cross-presentation[J].Justine D Mintern;;Christophe Macri;;Wei Jin Chin;;Scott E Panozza;;Elodie Segura;;Natalie L Patterson;;Peter Zeller;;Dorothee Bourges;;Sammy Bedoui;;Paul J McMillan;;Adi Idris;;Cameron J Nowell;;Andrew Brown;;Kristen J Radford;;Angus PR Johnston;;Jose A Villadangos.Autophagy,2015(6)

[5]邵体红.细胞自噬在肝星形细胞纤维化中的作用原发性胆汁性胆管炎血脂异常特点[D].北京协和医学院,2018.