细胞自噬检测服务

背景^[1-7]

细胞自噬检测服务用于研究多种因素能够诱导细胞发生自噬如饥饿、生长因子缺乏、微生物感染、细胞器损伤、蛋白质折叠错误或聚集、DNA损伤、放疗、化疗等。但是关于自噬信号的传递，现有的研究只明确了几种信号通路，包括抑制类和激活类，但具体的机制尚在研究中。

自噬（Autophagy），或称自体吞噬，是一个涉及到细胞自身结构通过溶酶体机制而被分解的过程，该过程是一个受到紧密调控的步骤，帮助细胞产物在合成、降解以及接下来的循环中保持一个平衡状态。细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个扁平的类似“脂质体”样的膜结构，称为Phagophore。随着Phagophore不断延伸，将胞浆中的细胞器等成分，全部包裹住成为密闭的结构，称为“自噬体（autophagosome）”。

自噬体形成后，可与溶酶体融合，自噬体中的内容物随即被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中，供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。自噬（Autophagy）是一类细胞内物质降解的代谢过程，待降解的胞内物质首先被自噬小泡包裹，随后被溶酶体中的水解酶降解。研究发现微管相关蛋白轻链3（MAP-LC3），简称LC3，参与了自噬的形成，并被证明了是哺乳动物细胞中常见的自噬小体标记蛋白之一。

Western blot可能会检测到LC3的两种形式，这是由于自噬形成时，胞浆型LC3会酶解掉一小段多肽形成LC3-I，LC3-I跟磷脂酰乙醇胺即脑磷脂(PE)结合转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），这两种形式在正常细胞中都是存在的，而发生自噬的细胞中LC3-II会有明显的增加。

自噬主要是通过ULK complex磷酸化Beclin-1，激活脂酶VPS34，诱导了细胞自噬发生，因此可以通过ULK complex和Beclin-1的相关基因的抑制剂来抑制自噬的形成，包括的靶点有MAP kinases,JNK1,ERK和p38。同时，细胞自噬还涉及了多种信号通路，如哺乳动物雷帕霉素靶点mTOR信号通路，是依赖mTOR的相关信号通路形成自噬的重要途径。

另外，其它信号通路中，如3-甲基腺嘌呤（3-MA）可以通过抑制ClassⅢPI3K的活性抑制自噬；GTP结合的G蛋白亚基Gαi3抑制自噬；GDP结合的Gαi3蛋白活化自噬；死亡相关蛋白激酶（death-associated protein linase,DAPK）和DAPK相关蛋白激酶（DAPK-related protein kinase-1,DRP-1）诱导自噬。PKA、casein激酶Ⅱ、MAP激酶、calcium途径也在自噬错综复杂的调控网格中，但其机制还不甚清楚。自噬病毒研究工具可以提供，便于直接感染目的细胞后直观地观察细胞自噬的整体水平；

1.GFP-LC3病毒系统：可高效感染目的细胞，表达GFP-LC3，感染感染后细胞可在荧光显微镜下实时观察自噬的整体水平；

2.自噬LC3双标腺病毒：mRFP-GFP-LC3腺病毒系统，可高效感染目的细胞，表达mRFP-GFP-LC3，感染后细胞可在荧光显微镜下实时观察自噬发生过程；

3.自噬LC3双标慢病毒：mRFP-GFP-LC3慢病毒系统，可以稳定表达持续检测细胞的自噬流检测；

4.AAV在体自噬流检测：最有效的在体自噬流检测工具，AAV-mRFP-GFP-LC3

应用^[8][9]

细胞自噬检测服务可用于研究癌症应激性死亡中的作用：

在细胞自噬在肝癌细胞内质网应激性死亡中的作用及对药物敏感性研究中，肝癌细胞始终处于病毒感染、营养缺乏、炎症刺激等各种不良的微环境中,这些不良刺激加上肿瘤的恶性增殖会使得大量未折叠／错误折叠蛋白在内质网腔内的积聚,导致内质网应激(ERS)状态。研究证实,ERS以及其引发的未折叠蛋白反应(UPR)与众多的细胞内信号转导途径相关,因此探讨ERS状态下的肝癌细胞增殖、生存和死亡的机制具有重要的意义。

自噬是细胞在缺氧、营养缺乏环境下通过自身降解来维持生存和细胞稳态的重要机制。近年研究表明,自噬与肿瘤的发生发展及肿瘤的治疗均有密切关系,但自噬究竟是发挥促癌还是抑癌的作用目前尚无定论。研究ERS状态下肝癌细胞的自噬活性的变化,以及自噬在肝癌细胞生存和死亡中的作用有助于进一步阐明肝癌的恶性生物学的分子基础和药物抵抗机制。

参考文献

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