细胞周期检测服务

背景^[1-7]

细胞周期检测服务通过核酸染料PI标记DNA,并由流式细胞仪进行分析，得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%、S%、G2/M%，了解增殖能力，在肿瘤病理学研究中，通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。细胞周期（Cell Cycle）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，细胞的遗传物质复制并均等地分配给两个子细胞。细胞周期分为间期与分裂期两个阶段。间期又分为三期：即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）与DNA合成后期（G2期）。某些细胞在分裂结束后暂时离开细胞周期，停止细胞分裂，执行一定生物学功能（G0期）。

细胞周期检测的原理：

PI法是经典的周期检测方法。PI为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。PI染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。

细胞周期内有两个阶段为重要：G1到S和G2到M；这两个阶段正处在复杂活跃的分子水平变化的时期，容易受环境条件的影响，如果能够人为地进行调控，将对深入了解生物的生长发育和控制肿瘤生长等有重要意义。能够方便有效地检测细胞周期的变化，对于药物研发和疾病研究等都具有重要的意义。单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。

测定细胞周期的方法很多，有同位素标记法、流式细胞仪法、基于细胞成像的荧光检测法等。流式细胞仪PI染色法检测细胞周期的原理：由于细胞周期各时相的DNA含量不同,通常正常细胞的G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N),而G2/M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N),而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。

PI可以与DNA结合，其荧光强度直接反映了细胞内DNA含量。因此,通过流式细胞仪PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时,可以将细胞周期各时相区分为G1/G0期,S期和G2/M期,获得的流式直方图对应的各细胞周期可通过特殊软件计算各时相的细胞百分率。

应用^[8][9]

细胞周期检测服务可用于调控细胞周期的机制研究：

在CyclinD1通过激活NDR调控细胞周期的机制研究中研究cyclinD1是否可以通过上调NDR1/2的活性来调控细胞周期的进程,制备了可诱导表达cyclinD1和cyclinD1K112E的稳定细胞株。Cyclin/Cdk蛋白激酶作为细胞周期调控最为关键的分子在细胞周期调控中发挥重要的作用。不同类型的cyclin/Cdk调控着细胞周期的不同的时期。其中cyclinDl/Cdk4主要在G1期发挥作用。

通过流式细胞术实验发现,不仅cyclinD1可以促进细胞周期G1/S期的进程,而且cyclinD1K112E也可以。这就证明cyclinD1可以通过不依赖于Cdk4的信号通路来调控细胞周期。而且还发现在正常细胞中过表达cyclinD1或cyclinD1K112E都可以促进细胞周期G1/S期的转换。为了进一步研究cyclinD1的这种功能是否与NDR1/2有关,先用siRNA敲低NDR1/2,再用流式细胞术来分析过表达cyclinD1对细胞周期的影响。

发现敲低NDR1/2后,过表达cyclinD1K112E对细胞周期的促进作用几乎消失。这就证明了cyclinD1可以通过调控NDR1/2的来调控细胞周期。由于NDR调控细胞周期是通过下调p21来起作用的,于是我们在稳定细胞系中敲低p21后,流失细胞术分析发现cyclinD1K112E不再促进S期的进程。鉴于cyclinD1是通过释放NDR的自身抑制序列来调控NDR活性的,我们在稳定细胞系中转染了NDR-IM,流式细胞术分析发现,过表达NDR-IM也可以抑制cyclinD1K112E的对细胞周期的促进作用。

参考文献

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[9]杜朝阳. CyclinD1通过激活NDR调控细胞周期的机制研究[D].中国科学技术大学,2013.