细胞增殖与活性检测服务

背景^[1-7]

细胞增殖与活性检测服务是直接测定DNA的合成，同时也是测定物质毒性、评估药物安全、细胞健康的基本方法。通过检测细胞增殖活性，可以指示肿瘤细胞增殖活性、目的基因瞬转/稳转细胞系的细胞增殖活性，在小分子化合物/多肽等药物筛选及功能安全性研究、中药/中间体等药物筛选及功能安全性研究、目的基因过表达的基因功能研究、目的基因RNAi干扰的基因功能研究中发挥重要作用。细胞增殖是生物体的重要生命特征，细胞以分裂的方式进行增殖，通过分裂，可以将复制的遗传物质，平均地分配到两个子细胞中去，是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。

单细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的个体。多细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的细胞，用来补充体内衰老和死亡的细胞；同时，多细胞生物可以由一个受精卵，经过细胞的分裂和分化，最终发育成一个新的多细胞个体。目前常用的细胞增殖检测方法包括胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）渗入法、MTT检测法、CFSE检测法、Brdu检测法、EdU检测法以及CCK8检测法。细胞增殖检测方法细胞增殖检测通常是检测分裂中的细胞数量或者细胞群体发生的变化。

目前细胞增殖检测主要分为五类：DNA合成检测、代谢活性检测、细胞数量检测、细胞增殖相关抗原检测和ATP浓度检测。在这些方法中作何选择，主要取决于所研究的细胞类型和研究方案。DNA合成检测这是目前实验室中检测细胞增殖最准确可靠的方式。该法是将放射性标记的3H-胸腺嘧啶与细胞一同孵育，这样新增殖细胞的DNA中就会掺入放射性标记，经洗脱后可用闪烁计数器检测。

该方法耗时长，而且有个明显的弊端就，即使用和处理放射性物质既麻烦又不安全。不过，可以使用5-溴-2-脱氧尿苷BrdU来进行类似实验，因为BrdU也同样可以掺入到新合成的DNA中。但这样就需要进行额外的实验步骤，先孵育特异性BrdU单抗和带标记的二抗，然后再进行比色法、化学发光检测或荧光信号检测等步骤。该方法的优点就是不再需要放射性物质。

BrdU标记很适合免疫组化IHC、免疫细胞化学IC、细胞内ELISA、流式细胞分析和高通量筛选。代谢活性检测检测细胞群体的代谢活性也可以反映细胞增殖的情况。在细胞增殖过程中脱氢酶的活性会增加，因此其底物四唑盐或Alamar Blue在代谢活跃的细胞环境中会逐渐减少，形成能够改变培养基颜色的甲臜染料。可以通过低配置或高配置的分光光度计和酶标仪来读取含染料培养基的吸光度，从而衡量细胞的代谢活性，检测细胞增殖的情况。

四种最常见的四唑盐是：MTT、XTT、MTS和WST1。MTT在标准的细胞培养基中是不溶的，而且其生成的甲臜晶体需要溶解在DMSO或者异丙醇中。因此，MTT主要作为终点检测方法。其他三种盐与Alamar Blue一样，都是可溶且无毒。它们可以作为连续监控手段来跟踪细胞增殖的动态改变。其中XTT的效率较低，需要添加额外的因子；WST1更灵敏有效，与其他盐相比能够更快显色；Alamar Blue的灵敏度也很高，只要微孔板的孔中有100个细胞就能够检测到。四唑盐和Alamar Blue氧化还原染料能够用于多种仪器和高通量研究，非常方便。它们适用的检测仪器包括：标准分光光度计、荧光分光光度计和酶标仪等。

应用^[8][9]

细胞增殖与活性检测服务可用于药物的细胞增值及活性检测：

在miR-29b在慢性粒细胞白血病细胞增殖及凋亡中的作用及其机制研究中miR-29b在慢性粒细胞白血病中的表达及临床意义慢性粒细胞白血病(Chronic myelogenous leukemia,CML)是一类起源于造血干细胞的疾病，该病的特征是9号染色体和22号染色体易位形成的bcr/abl融合基因，该基因编码的融合蛋白具有持续激活的酪氨酸激酶活性。

Imatinib作为代BCR/ABL酪氨酸激酶抑制剂在CML的治疗中已经取得了很大的成功，该小分子抑制剂治疗效果好，毒性相对较低。但是，临床上对该药物的耐药越来越明显。采用慢性粒细胞白血病急变细胞株K562细胞为研究对象，转染miR-29b模拟物上调K562细胞中miR-29b表达，分析了miR-29b对该细胞增殖、克隆形成能力、细胞周期及细胞凋亡的影响。

MTT的结果显示经miR-29b处理后的K562细胞增殖减慢；克隆形成实验结果显示，与转染NC或者未转染的K562细胞相比，miR-29b显著降低了K562细胞的克隆形成能力；流式细胞术分析细胞周期结果显示miR-29b使K562细胞周期阻滞于G1期，定量PCR和Western blot的结果进一步证实miR-29b主要是通过上调p21和p27基因和蛋白水平而使细胞周期受阻；瑞氏染色可见miR-29b处理后的K562细胞出现明显的凋亡样改变，流式细胞术分析细胞凋亡显示早期和晚期凋亡细胞百分数增多。

Western blot结果显示miR-29b主要是通过活化caspase3及其底物来诱导细胞凋亡，而且也检测到促凋亡蛋白BAX的上调和抗凋亡蛋白BCL-2的下调。这些结果提示，miR-29b能负向调控K562细胞的增殖并促进其凋亡。第三部分miR-29b调控慢粒细胞增殖及凋亡的机制研究我们在第二部分中已经证明miR-29b能参与调控K562细胞增殖和凋亡。

参考文献

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[8]Mechanisms of miRNA-mediated post-transcriptional regulation in animal cells[J].Marina Chekulaeva,Witold Filipowicz.Current Opinion in Cell Biology.2009(3)

[9]李亚娟.miR-29b在慢性粒细胞白血病细胞增殖及凋亡中的作用及其机制研究[D].重庆医科大学,2013.