CALU-1 人肺癌细胞的应用

背景^[1-3]

CALU-1人肺癌细胞是一种常用的细胞系，广泛应用于癌症研究、毒理学实验等领域。这种细胞系是从一名47岁的白人男性患者的肺鳞癌胸腔积液转移病灶中分离出来的。CALU-1细胞表现出上皮细胞样的形态，具有丰富的超微结构特征，包括微绒毛、粗面内质网、溶酶体和脂包含体，并且不含有病毒颗粒。此外，这些细胞含有ras（H-ras和K-ras）癌基因。

在培养方面，CALU-1细胞在McCoy’s 5A培养基中生长，需要添加10%的胎牛血清和1%的抗生素/抗真菌剂。培养条件为37°C、5%CO2，并且建议每周更换培养基2-3次。传代时，当细胞密度达到80%-90%时，可以使用0.25%胰蛋白酶-0.53mM EDTA消化细胞，然后按照1:2到1:4的比例传代。

CALU-1细胞具有致瘤性，能在裸鼠身上形成表皮样癌，在类固醇治疗的仓鼠中形成转移。这些细胞也表现出血型A、Rh+抗原表达，并具有HLA A10、A11、B15、Bw35的抗原谱。在分子水平上，它们是亚三倍体，模态染色体数目为62，存在7个频繁出现的标记物。

CALU-1人肺癌细胞

CALU-1人肺癌细胞培养操作

1)复苏CALU-1人肺癌细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)CALU-1人肺癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)CALU-1人肺癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

CALU-1人肺癌细胞可以用于单核细胞在新型冠状病毒引发的细胞因子风暴中的作用和机制研究

围绕单核细胞的功能和细胞因子分泌,来探讨其在新型冠状病毒引发的细胞因子风暴中的作用和机制,以期对COVID-19的治疗提供参考数据。已有研究表明,血管紧张素转化酶2(ACE-2)为引起SARS冠状病毒和新型冠状病毒的主要结合受体。

本研究以流式细胞术和Western blotting检测发现,CALU-1人肺癌细胞表面高表达ACE-2蛋白。用SARS-Co V-2刺突蛋白S刺激CALU-1人肺癌细胞,经i TRAQ蛋白组分析后与人类蛋白数据库对比,发现GM-CSF和CD40L的表达明显升高,可能导致肺上皮细胞通过CD40L/CD40途径,调节肺部单核细胞活化和炎症细胞因子的分泌。利用Western blotting和q RT-PCR方法,对i TRAQ蛋白检测结果进行了印证。接下来,取来自志愿者提供的人浓缩白细胞,分离得到外周血单个核细胞(PBMC),建立肺上皮细胞与单核细胞共培养实验,研究SARS-Co V-2激活单核细胞的作用和机制。

不同浓度的SARS-Co V-2-S刺激CALU-1人肺癌细胞,ELISA和PCR实验分析GM-CSF的分泌和表达,流式细胞术分析CD40L的表达。结果表明,SARS-Co V-2-S可以显著上调Calu-1细胞GM-CSF的分泌和CD40L的表达(P<0.01)。ACE-2抗体阻断实验证明,SARS-Co V-2-S作用于CALU-1人肺癌细胞依赖于ACE-2受体。SARS-Co V-2-S刺激Calu-1细胞与单核细胞后,检测单核细胞表型和炎症因子的分泌,流式细胞术检测单核细胞表型。

结果显示,CALU-1人肺癌细胞与单核细胞共培养,并不能引起单核细胞表型变化,但是当在共培养体系中加入SARS-Co V-2-S后,单核细胞表达的CD86(2.1±0.22,P<0.05)和HLA-DR(3.5±0.32,P<0.01)显著增高,提示单核细胞获得了M1性巨噬细胞的炎症表型。细胞内染色和ELISA检测结果表明,SARS-Co V-2-S通过Calu-1细胞刺激单核细胞分泌IL-18和IL-1β,说明SARS-Co V-2-S通过作用于肺上皮细胞激活单核细胞,促进了单核细胞向M1炎症表型的分化。

Western blotting实验结果表明,SARS-Co V-2-S通过激活CALU-1人肺癌细胞的PI3K/AKT,诱导肺上皮细胞分泌GM-CSF,并上调表达了CD40L。在SARSCo V-2-S刺激的Calu-1细胞与单核细胞共培养体系中,加入CD40的封闭抗体或GM-CSF的中和性抗体,单核细胞的CD86的表达和HLA-DR的表达明显下降(P<0.05),细胞培养上清中的IL-18和IL-1β显著下降(P<0.01)。以上结果表明,SARS-Co V-2-S激活CALU-1人肺癌细胞,通过CD40L/CD40和GM-CSF参与单核细胞的活化,引起单核细胞炎症表型和炎症细胞因子的分泌。

综上所述,本研究探讨了单核细胞在新型冠状病毒引发的细胞因子风暴中的作用和机制。发现了SARS-Co V-2通过S蛋白结合CALU-1人肺癌细胞表面ACE-2受体,激活细胞内PI3K/AKT通路,诱导肺上皮细胞分泌GM-CSF,并上调表达了CD40L。激活Calu-1细胞,通过CD40L/CD40和GM-CSF参与单核细胞的活化,引起单核细胞炎症表型和炎症细胞因子的分泌。

参考文献

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[2]Mesenchymal Stem Cells in the Treatment of COVID-19,a Promising Future[J].Beghini Daniela Gois;Horita Samuel Iwao;HenriquesPons Andrea.Cells,2021

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[4]Monocytes and Macrophages in COVID-19[J].Knoll Rainer;Schultze Joachim L.;Schulte Schrepping Jonas.Frontiers in Immunology,2021

[5]靳宇.单核细胞在新型冠状病毒引发的细胞因子风暴中的作用和机制研究[D].吉林大学,2022.