细胞系定制服务

背景^[1-6]

细胞系定制服务是将外源质粒DNA整合到宿主细胞染色体上，使宿主细胞可长期表达目的蛋白，称稳定细胞系。高质量的稳定细胞系在生物学研究中扮演着非常重要的角色，包括基因功能研究、重组抗体、药物开发等。细胞系定制服务构建的细胞系可直接应用于各种下游的生物学研究，包括基因调控、蛋白质工程、重组抗体制备、药物研发等。细胞系定制服务包括基因过表达（Reporter细胞系、GPCR细胞系、离子通道细胞系等）、Knockdown、Knockout细胞系等。

1. 过表达细胞系服务

目的基因过表达是研究基因功能常用的手段之一。基因过表达稳定细胞系已经广泛应用于生物学研究，包括基因调控、蛋白质工程、重组抗体制备、药物研发等。将目的基因通过转染或病毒包装的方法，能够实现目的基因过表达的稳定细胞系。过表达稳定细胞系有GPCR、Reporter和离子通道稳定细胞系等，此外还可以根据客户的需要进行量身定做，在各种哺乳动物细胞中过表达各种基因。基于完善的基因过表达技术，过表达细胞系服务可将目的基因定点整合到基因组的高表达活性位点中，这些位点不仅安全而且基因表达量高，可以实现目的基因过表达，并能长期稳定遗传。

2. Knockdown(基因敲低)细胞系服务

RNA干扰是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。现今发现的主要起干扰作用的主要有两类小分子RNA：一类是microRNA；另一类是siRNA。siRNA制备的方法一般有:化学合成siRNA，哺乳动物细胞载体shRNA克隆和慢病毒载体shRNA克隆。shRNA需通过载体导入细胞后，然后利用细胞内的酶切机制得到siRNA而最终发挥RNA干扰作用。

在细胞水平上，利用RNA干扰技术来抑制目标基因的表达，从而获得knockdown的基因敲低细胞系，已广泛应用于研究基因功能，设计疾病模型和药物研发中。安必奇凭借先进的实验技术，完善的实验平台可以针对各种目标基因设计高效的shRNA，并利用shRNA的慢病毒表达载体，构建种类齐全的各种基因knockdown稳定细胞系。

3. Knockout(基因敲除)细胞系服务

Knockout基因敲除细胞或动物模型一直以来是开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶点的重要工具。CRISPR/Cas系统是细菌的一种适应性免疫机制，用来抵抗各种外来核酸的入侵。CRISPR/Cas9技术与ZFN、TALEN相比，更为高效、便捷，成为基因编辑的一个重要工具，在基因工程领域开创了新纪元。改造优化后的CRISPR/Cas9系统由两部分组成：sgRNA和Cas9蛋白。sgRNA特异性识别靶位点后，Cas9蛋白在靶位点附近进行切割，从而形成DSB。

技术流程：

1.载体构建-目的基因过表达载体的构建。

2.病毒包装-表达载体、辅助质粒共转染293FT细胞，收集病毒上清，纯化和浓缩病毒颗粒。若选择转染，则跳过此步。

3.转染、转导-电转染或转染试剂（脂质体等）进行细胞转染，或病毒转导。

4.筛选-根据表达载体的筛选基因选择药物进行筛选，如嘌呤霉素、G418等。

5.扩大培养-将筛选出的单克隆细胞进行扩大培养。

6.鉴定-PCR、Q-PCR、western等从DNA、mRNA、蛋白水平进行检测。

应用^[7][8]

细胞系定制服务可用于设计疾病模型，用于研究疾病的诊断治疗方法。

在骨肉瘤干细胞及其多药耐药性的体内外相关研究：骨肉瘤是人类最常见的恶性骨肿瘤,好发于青少年,恶性程度高,易发生早期转移,有较高的致死和致残率。研究骨肉瘤多药耐药的机制首先要在体内外建立骨肉瘤多药耐药的模型。耐药模型的建立的方法一般有两种：成熟细胞系诱导或者耐药骨肉瘤细胞原代培养。其中前者更具有稳定性、代表性和说服力U2OS是研究常用的人骨肉瘤细胞系,但由于其体内致瘤率低而不利于体内实验的进行,因此我们还选取了具有较高致瘤性的MNNG/HOS人骨肉瘤细胞系,通过化疗药物诱导建立此三种细胞系的骨肉瘤多药耐药细胞模型。骨肉瘤干细胞是骨肉瘤中一小群具有自我更新和分化功能的细胞。通常这部分细胞处于静止期,当受到刺激或者周围微环境改变时,它就会不断增殖分化成异质性的肿瘤细胞。骨肉瘤干细胞具有无限增殖、多药耐药和高致瘤性等特点,常规治疗方法很难将其杀灭,所以它们被看做是骨肉瘤耐药、复发和转移的罪魁祸首。

参考文献

[1]Long-circulating PEG-PE micelles co-loaded with paclitaxel and elacridar(GG918)overcome multidrug resistance[J].Can Sarisozen,Imran Vural,Tatyana Levchenko,A.Atilla Hincal,Vladimir P.Torchilin.Drug Delivery.2012(8)

[2]Curcumin inhibits proliferation and invasion of osteosarcoma cells through inactivation of Notch‐1 signaling[J].YonggangLi,JingruZhang,DaoxinMa,LeiZhang,MengSi,HanYin,JianminLi.FEBS Journal.2012(12)

[3]Side population cells isolated from human osteosarcoma are enriched with tumor‐initiating cells[J].Min Yang,Ming Yan,Rui Zhang,Jing Li,Zhuojing Luo.Cancer Science.2011(10)

[4]H1,a derivative of Tetrandrine,exerts anti-MDR activity by initiating intrinsic apoptosis pathway and inhibiting the activation of Erk1/2 and Akt1/2[J].Ning Wei,Geng-Tao Liu,Xiao-Guang Chen,Qian Liu,Feng-Peng Wang,Hua Sun.Biochemical Pharmacology.2011(11)

[5]Accumulation of lactosylceramide and overexpression of a PSC833-resistantP-glycoprotein in multidrug-resistant human sarcoma cells[J].Nassera Aouali,Hassan El Btaouri,Charles Dumontet,Lahcen Eddabra,Sophie Malagarie-Cazenave,Claudie Madoulet,Hamid Morjani.Oncology Reports.2011(4)

[6]Mesenchymal stem cells expressing GD2 and CD271 correlate with breast cancer-initiating cells in bone marrow[J].Ugo De Giorgi,Evan N.Cohen,Hui Gao,Michal Mego,Bang-Ning Lee,Ashutosh Lodhi,Massimo Cristofanilli,Anthony Lucci,James M.Reuben.Cancer Biology&Therapy.2011(9)

[7]Rapid and efficient reprogramming of human amnion-derived cells into pluripotency by three factors OCT 4/SOX 2/NANOG[J].Hong-xi Zhao,Yang Li,Hai-feng Jin,Li Xie,Chuang Liu,Feng Jiang,Ya-ning Luo,Guo-wu Yin,Yi Li,Jun Wang,Ling-song Li,Yuan-qing Yao,Xiao-hong Wang.Differentiation.2010(2)

[8]司萌.骨肉瘤干细胞及其多药耐药性的体内外相关研究[D].山东大学,2013.