基因突变体文库构建

背景^[1-7]

基因突变体文库构建是大量DNA变体序列的组合，是基因合成、基因突变和定向进化研究相结合的产物。基因突变文库已经越来越多地应用于研究领域，如高通量药物靶点筛选，蛋白质工程定向进化，合成多样性抗体库用来筛选高亲和力和特异性的变异抗体等。基因突变体文库构建是利用分子定向进化模拟自然选择过程，改变原有蛋白的氨基酸序列，以期获得具有特定功能的突变蛋白。

分子定向进化是利用现代分子生物学方法创造大量的突变同源基因文库人为模拟自然进化机制，采用灵敏的定向筛选策略，创造出自然界不存在的或某些特性有显著改变的突变蛋白质或其他生物分子。分子定向进化已广泛应用于蛋白质的分子改造，被认为是改良全新蛋白质特性或调控序列的最高效方法。

DNA文库可以改变蛋白质的特定位点或者DNA的调控区域，可以用来研究结构和功能之间的关系。根据不同设计目的，体外合成的文库可以更精确更随意的控制所研究序列的多样性。而且，合成的DNA文库可以显著提高获得核酸或蛋白质突变体的效率，有助于下游研究。基因突变文库合成服务包括：丙氨酸扫描文库，简并突变文库，三联体文库，定点饱和突变文库，随机突变文库等。

1.丙氨酸扫描文库（Alanine Scan Library）

通过用丙氨酸逐一取代每一个位置或关键位置的氨基酸，发现对蛋白功能、相互作用和形态具有重要作用氨基酸残基。

2.定点饱和突变文库（Site Saturation Library）

通过检测任一位点包含所有20种氨基酸，用于检测蛋白的一级结构与结构和功能之间的关系。

3.氨基酸随机突变文库

通过Syno®Random PCR Platform，实现可控、高精度的随机化突变合成（A，T，C，G四种碱基在每个突变位点的均一性都更好）。随机突变频率可以精确控制在1-4个突变/kb，4-8个突变/kb，和8-12个突变/kb中任意一种形式。

应用^[8][9]

1.筛选具有改良性状（高亲和力、特异性）的抗体、配体及受体等；

免疫球蛋白结合蛋白(immunoglobulin(Ig)-binding proteins,IBPs)是由多种病原菌产生,与免疫球蛋白之间以非抗原形式结合,是一种重要的致病因子。其中代表分子包括有部分大消化链球菌表面蛋白L(Peptostreptococcus magnus protein L,Pp L)、链球菌(C群和G群)蛋白G(Streptococcal protein G,Sp G)和金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal protein A,Sp A)等等。

这类分子是由数目不同的功能相似的单结构域组合形成。因其独特结合特性,该类分子在抗体纯化、鉴定,抗体吸附治疗和病原体特异性抗体检测等方面应用广泛。利用体外分子进化获得了由Sp A A Ig结合结构域和Sp A C Ig单结构域随机重新组合构成的重组分子Sp A-AC,该分子是由Sp A中的E、D、A、B、C和Sp G中的B2、B3各单结构域随机重组后,利用噬菌体展示技术筛选出来的具有高结合活性的重组IBPs。

因此,为了获得具有更高结合活性的免疫球蛋白结合分子,本研究对Sp A的A和C结构域上Fc结合位点氨基酸进行随机突变,构建噬菌体展示文库A1C1,对Sp A的A和C结构域上Fc结合位点周围的氨基酸进行随机插入突变,构建噬菌体展示文库AI37CI20。

2.分子定向进化、研究蛋白质结构和功能关系、探讨基因调控机制等。

在玉米赤霉烯酮降解菌Bacillus amyloliquefaciens MQ01突变体文库的构建实验中构建玉米赤霉烯酮降解菌Bacillus amyloliquefaciens MQ01突变体文库,以期获得丢失玉米赤霉烯酮降解功能的突变子,克隆玉米赤霉烯酮降解酶基因,阐明MQ01降解玉米赤霉烯酮的分子机制。将携带转座子TnYLB-1的穿梭载体pMarA电转化至玉米赤霉烯酮降解菌Bacillus amyloliquefaciens MQ01中,50℃高温条件下,把穿梭载体pMarA上转座子TnYLB-1随机插入到菌株MQ01基因组中,获得转座子插入突变的阳性克隆,构建MQ01菌株的突变体文库,随机挑选突变子采用PCR和Southern杂交方法进行验证。

本研究成功获得了3 000多个TnYLB-1转座子插入突变的阳性克隆,构建了B.amyloliquefaciens MQ01的突变子文库,结果显示TnYLB-1转座子以单拷贝的形式随机插入到B.amyloliquefaciens MQ01的基因组DNA中,从而可以从转座子突变文库中筛选丢失玉米赤霉烯酮降解功能的转座突变子,从菌株MQ01中克隆玉米赤霉烯酮降解酶基因。

参考文献

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