cDNA文库构建

背景^[1-6]

cDNA文库构建是将mRNA在体外反转录成cDNA，与适当质粒载体连接后转化受体菌，进行繁殖扩增。最终获得包含组织或细胞全部mRNA信息的cDNA克隆群体。cDNA文库构建经典方法是用Oligo(dT)作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。其基本步骤包括：RNA的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取方法的选择主要根据不同的样品而定)，要构建一个高质量的cDNA文库，获得高质量的mRNA是至关重要的，所以处理mRNA样品时必须仔细小心。

由于RNA酶存在所有的生物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建立一个无RNA酶的环境对于制备优质RNA很重要。在获得高质量的mRNA后，用反转录酶Oligo(dT)引导下合成cDNA第1链，cDNA第2链的合成(用RNA酶H和大肠杆菌DNA聚合酶I，同时包括使用T4噬菌体多核苷酸酶和大肠杆菌DNA连接酶进行的修复反应)，合成接头的加入、将双链DNA克隆到载体中去、分析cDNA插入片断，扩增cDNA文库、对建立的cDNA文库进行鉴定。

这里强调的是对载体的选择，常规用的是λ噬菌体，这是因为λDNA两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可用来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳大片段的外源DNA。cDNA便于克隆和大量表达，它不像基因组含有内含子而难于表达，因此可以从cDNA文库中筛选到所需的目的基因，并直接用于该目的基因的表达。

通过构建cDNA文库是以特定的组织或细胞mRNA为模板，逆转录形成的互补DNA(cDNA)与适当的载体(常用噬菌体或质粒载体)连接后转化受体菌形成重组DNA克隆群，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织或细胞的cDNA文库。cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。

cDNA文库构建步骤包括：

（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA文库的关键步骤之一。

（2）cDNA条链的合成。

（3）cDNA第二条链的合成。

（4）双链cDNA的修饰。

（5）双链cDNA的分子克隆。

（6）cDNA文库的扩增。

（7）cDNA文库鉴定评价。

应用^[7][8]

cDNA文库在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。随着生物及信息技术的迅速发展，寻找新基因、克隆新基因、进而研究基因的功能已成为功能基因组研究中的一项重要工作。

在过去寻找新基因的方法中，以消减杂交、mRNA差异显示，cDNA的代表性差异显示分析法、差异消减展示等方法应用最广。这些方法在新基因的发现方面都各有其独特的优势，可寻找出一些差异表达序列，但这些差异表达序列大部分情况都是不完整的基因。

目前，比较可行而且应用较多的方法主要还是cDNA文库的筛选。一方面cDNA文库只代表一定时期一定条件下正在表达的基因，是整个真核基因组中的少部分序列，因此cDNA克隆的复杂程度比直接从基因组克隆的要小得多；另一方面由于每个cDNA克隆只代表一种mRNA序列，因此在基因克隆过程中出现假阳性的概率比较低，所以cDNA文库的构建已成为当前分子生物学研究和基因工程操作的基础。

参考文献

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