小鼠心肌细胞的分离

背景及概述^[1-2]

随着“人类基因组计划”完成，功能基因组时代的到来，探索基因的功能则显得格外重要与紧迫。细胞转染与转基因小鼠则是探索基因功能的两种重要技术。为了探索心肌中功能相关基因的作用，需要获得高质量与高产量的小鼠心肌细胞。有实验为观测模拟失重小鼠心肌细胞功能的变化，须建立完善的小鼠心肌细胞分离技术，为后续的实验打下良好的基础。以往普遍采用恒压灌流的Langendorff装置分离成年大鼠心肌细胞，其分离的产量与质量不稳定，主要原因是对消化终点的判断不准确；小鼠心脏较小，且个体差异性较大，消化程度更难以掌握。近年来较多研究采用恒流灌流方法分离成年小鼠心肌细胞，可依赖灌流压力决定消化终点，但细节不甚清楚。

分离

1. 小鼠心肌细胞的分离

小鼠腹腔注射肝素(5000IU/kg)，20min后行颈椎脱臼断离脊髓处死。迅速开胸摘取心脏，置含10mmol/LNaHCO3，10mmol/LHEPES，10mmol/LBDM，pH7.20~7.30的Joklik’sMEM培养液(A液)中清洗血液，清理残余肺叶与多余的脂肪组织，迅速行主动脉插管。将心脏悬挂于Langendorff灌流装置上，0号丝线扎紧主动脉于插管上。以37℃A液行恒流非循环灌流，稳定1min后，微调流速使灌流压保持在40mmHg。清洗灌流5min，换用40ml消化酶液(含0.05%胶原酶Ⅰ与0.1%BSA的A液)行循环灌流。当灌流压力降至预定值时，换成A液清洗5min。用压力传感器检测灌流压力的变化，RM6240B型多道生理信号采集与处理系统记录压力变化曲线。

2. 心肌细胞的收集与复钙

取下消化酶作用后的心脏，立刻放入细胞收集与保存液(含1%BSA的A液)中，剪去心房以及其它非心室组织。将心室肌剪成约1mm3的小块，放入离心管中用较大口径的吸管进行轻柔吹吸，直至心肌细胞完全散开。经200目尼龙网过滤。将细胞以100×g离心2min，弃上清液。加入20ml细胞收集与保存液，悬浮心肌细胞后，以100%O2进行氧合，室温下静置30min。采用分步复钙法使溶液内Ca2+浓度达到1.25mmol/L。用血球计数板计数全部细胞，以计算收获量。在固定的视野内，按体视学原则[3]计数长杆状细胞与全部细胞的数量。

存活心肌细胞百分比=(长杆状细胞数量／全部细胞数量)×100%

3. 心肌细胞收缩功能测量

吸取少量心肌细胞悬液至0.3ml容积的灌流槽内，将灌流槽置OlympusIX70倒置显微镜上，静置10min使心肌细胞贴壁。然后，采用100%氧气氧合的HEPES缓冲液行非循环灌流，HEPES缓冲液的组成为(mmol/L)：132.0NaCl、4.8KCl、1.2MgCl2、10.0HEPES、10.0葡萄糖、1.8CaCl2，pH7.20。灌流速度为0.3ml/min。使用场刺激引发心肌细胞收缩，方波刺激，波宽5ms，刺激电压15V，刺激频率分别为1.0、2.0和5.0Hz。采用Edge-Detector系统(Crescent，USA)监测心肌细胞两端的缩短幅度变化，Felix软件系统（PTI，USA）采集与分析心肌细胞无负荷收缩信号。按下列公式计算心肌细胞缩短幅度：

心肌细胞缩短幅度=[(心肌细胞舒张长度－收缩末长度)/舒张长度]×100%

4. 结果

1）灌流压力的动态变化：调节灌流量，使初始灌流压稳定在40mmHg。换含胶原酶的消化液灌流后，灌流压逐渐升高，在作用大约5min后达值，然后缓慢下降(图1)。当灌流压高于30mmHg时终止消化，观测5例均只获得少量杆状心肌细胞，且大量细胞聚集成团，存活细胞小于10%；当灌流压为28mmHg时终止消化，观测6例存活细胞均大于70%；当灌流压小于25mmHg时终止消化，观测3例存活细胞波动在20~40)%范围内，且细胞明显消化过度：细胞横纹模糊，折光性差，细胞膜表面可见泡状结构，易死亡。

2）小鼠鼠龄对灌流的影响：随着小鼠鼠龄增加，灌流压力曲线的变化规律并未改变，在初始灌流压保持不变的条件下，初始灌流流速增加，酶消化时间延长(表1)。

3）心肌细胞收获量

每个心脏分离细胞的总量为3.0×106~6.0×106个细胞(n=6)。体视学计数表明，分离即刻，存活心肌细胞为(75.33±10.93)%；复钙后降至(50.17±4.96)%，与分离即刻具有非常显著性差别(P<0.01)；静置4h后，存活心肌细胞为(40.67±5.79)%，与复钙后即刻的观测均值间无显著性差别(P>0.05)；5.0Hz刺激5min后，存活心肌细胞进一步降低至(33.83±4.67)%，与复钙后即刻及静置4h的观测均值间均具有显著性差别(P<0.05)。

4）心肌细胞质量

采用0.4%台盼蓝排斥试验显示，长杆状心肌细胞均拒染，圆形细胞均被染成蓝色。90%以上的长杆状心肌细胞伸直舒展，细胞无明显搏动，呈现清晰的横纹，细胞膜表面光滑，两端边缘锐利(图3A、B、C、D)，折光性较强(图3B)。恢复细胞外钙离子浓度至1.25mmol/L并静置4h后(图3B、C、D)，心肌细胞仍能保持这些形态特征。但也有少量心肌细胞横纹模糊，细胞膜表面呈现密集小泡(图3E)，或折光性较差，细胞呈透明状(图3F)，有些则出现细胞两末端变圆变钝，甚至出现“菜花状”膨大(图3G)，有些细胞弯曲或挛缩(图3H)。

5）心肌细胞缩短幅度：在1.0Hz刺激条件下，心肌细胞缩短的幅度为(9.72±0.43)%。2.0Hz刺激使心肌缩短幅度达到(11.28±0.43)%，与1.0Hz相比，两组间差别达显著水平(P<0.05)。在5.0Hz刺激下，心肌细胞缩短幅度进一步增加到(11.40±0.45)%，与1.0Hz相比，具有非常显著性差别(P<0.01)。

主要参考资料

[1] 儿科学辞典

[2] 成年小鼠心肌细胞分离技术