小鼠皮肤成纤维细胞的培养

背景及概述^[1-2]

成纤维细胞是疏松结缔组织中最常见而且数量较多的一种细胞，位于胶原纤维近旁并依附于其上。此细胞的形态结构可随其功能状态的不同而改变。在功能活动旺盛时，成纤维细胞的胞体较大，呈扁平星形，有突起。胞核呈卵圆形，核染色质较少，着色浅，核仁明显。胞质较多，弱硷性，内含丰富的粗面内质网、核蛋白体、高尔基复合体以及微丝和微管等结构，表明此种细胞具有合成和分泌胶原蛋白、弹性蛋白和多糖蛋白，形成胶原纤维、弹性纤维、网状纤维和基质的作用。在相对静止或功能活动不活跃时的细胞，称为纤维细胞。这种细胞比成纤维细胞小，轮廓不甚清楚，多呈梭形。胞质少，弱嗜酸性，其中粗面内质网、高尔基复合体及其它细胞器均不发达。这表明纤维细胞是功能活动不活跃的细胞。但在一定条件下，如创伤修复，结缔组织再生时，纤维细胞可转化为功能活跃的成纤维细胞，积极参与合成和分泌蛋白质，形成纤维和基质。简便快速分离培养成纤维细胞对是否能在体外成功建立模拟肿瘤微环境具有重要意义。成纤维细胞是疏松结缔组织的主要细胞，属生长与裂殖迅速的细胞族群，在适当的体外培养条件下，能迅速增长繁殖。同时，成纤维细胞不仅能提供完整的遗传物质，而且培养方便，对动物的生长和繁殖都无影响。有研究以小鼠皮肤作为材料探讨一种简单有效的小鼠皮肤成纤维细胞体外培养方法，从形态学、免疫荧光、流式细胞术、Westernblot等方法鉴定成纤维细胞波形蛋白的表达情况，为成功建立体外模拟肿瘤微环境打下基础。

培养^[2]

1. 小鼠皮肤成纤维细胞组织块培养法

1)小鼠成纤维细胞组织块培养法在已有文献基础上优化进行。将刚出生的小鼠处死，75%酒精浸泡消毒后，放入生物安全柜内进行操作。先取其背部皮肤，放入75%酒精中浸泡消毒，以无Ca2+、Mg2+PBS漂洗皮肤。其次，将皮肤剪成1mm2大小，均匀平贴于无菌平皿中，加入适量DEME完全培养基，37℃、5%CO2培养24h，使皮肤能够牢固平贴于平皿上。24h后再加入足量的培养基37℃、5%CO2培养，1周后将组织块去除，即可见成纤维细胞生长（在这1周内除了中间换1次培养基，尽量勿动培养平皿）。此后，每2天换1次培养液，8~10d后可见细胞铺满皿底，消化传代。

2)成纤维细胞传代

当去组织块后的成纤维细胞在培养平皿中长成片可传代时，吸去旧培养液，用无Ca2+、Mg2+PBS漂洗1次，加入0.05%胰蛋白酶，覆盖皿底细胞，在室温下轻轻吹打。将平皿在倒置显微镜下观察，消化5min左右后，发现成纤维细胞变圆时，立即加入等体积的DEME完全培养基终止胰酶反应，用吸管轻轻吹打，吹打结束后，将细胞悬液移入离心管，1200r/min离心8min，弃上清液后加入DEME完全培养液，吹散混匀按1∶2浓度传代，以后每2~3天传代1次。

3)冻存与复苏

①冻存：细胞长满为细胞单层时，吸干培养液，以无Ca2+、Mg2+PBS漂洗后加入0.05%胰蛋白酶室温消化，细胞变圆时，加DMEM完全培养液终止。将细胞悬液移入离心管，1200r/min离心8min，弃上清液后将细胞悬浮于含10%二甲亚砜（DMSO）∶10%胎牛血清的DMEM完全培养液中，细胞密度为1×1065×106/ml。分装于冻存管中。经梯度降温后冻存于液氮中备用。②复苏：自液氮取出细胞，快速放入37℃水浴，融化后加入5倍左右的DMEM完全培养液，离心（1200r/min）8min，弃上清后，加入DEME完全培养液，使细胞浓度为1×106/ml，37℃、5%CO2培养箱培养过夜，细胞贴壁后更换培养液。

4)免疫荧光成纤维细胞免疫荧光显微镜检测

波形蛋白表达方法按公司产品说明书并按参考文献进行。先以无Ca2+、Mg2+PBS漂洗细胞，加入预冷4%多聚甲醛固定15min并用PBS漂洗2遍；次以预冷的PBST孵育细胞30min，无Ca2+、Mg2+PBS漂洗3遍；继以预冷的1%牛血清白蛋白（BSA）封闭细胞30min，1∶20稀释兔抗小鼠波形蛋白单抗湿盒孵育细胞，4℃过夜后以兔抗小鼠波形蛋白单抗PBS漂洗3遍；再以1∶50稀释FITC标记羊抗兔二抗湿盒孵育细胞，室温下避光1.5h；最后以PBS漂洗3遍，DAPI染色细胞后，荧光显微镜观察拍照。

5)流式细胞术流式细胞

胞内染色按照试剂盒说明书并参考文献进行。收集细胞，先以CD16/CD32抗体按照1μg/1×106细胞的用量室温孵育15min以封闭细胞表面的Fc受体，冷PBS洗涤2次，每次洗涤后1200r/min离心5min，弃上清；其次，加入100μl的固定液，室温避光固定细胞20min，以1.0ml的穿膜缓冲液洗涤2次，每次洗涤后1200r/min离心5min；最后，重悬细胞于100μl的穿膜缓冲液中，加入相应的兔抗小鼠波形蛋白单抗PBS漂洗3遍；再以FITC标记羊抗兔二抗荧光抗体，室温避光染色，经1.0ml的穿膜缓冲液洗涤2次，每次洗涤后1200r/min离心5min，以FACSCalibur检测胞的表面分子并以CellQuest软件分析数据。

2. 结果

1)小鼠成纤维细胞分离培养结果

原代培养的细胞经光镜观察，发现组织块贴壁3d后就可在组织块周围看到明显的成纤维细胞的生长，此时游离出来的细胞呈纺锤形或者不规则三角形，周围有少量上皮细胞，胞核清晰，除贴壁的细胞团外，一般不形成集落，如图1A所示。培养第5天，组织块周围有大量的成纤维细胞，成纤维细胞群开始向外分裂生长，此时细胞呈典型的长梭形，如图1B所示。培养第7天，组织块中基本不再游离出细胞，原游离的细胞呈现群体依赖性生长，呈典型的梭形，此时细胞可生长成单层，漩涡状排列或纵横交错，贴壁的细胞团呈放射状生长，如图1C所示。去掉组织块，10d左右由组织块移出的单层细胞铺满瓶底，可消化传代，进行传代培养。传代时可离心弃上清后重悬细胞，以弃去多余的组织碎片，传代后48~72h，细胞可铺满皿底。细胞经冻存复苏后，可见细胞生长旺盛，形态无异常，如图1D所示。

2)小鼠成纤维细胞免疫荧光鉴定结果

原代培养的成纤维细胞以其表达的波形蛋白行免疫荧光鉴定，结果发现：诱导的细胞均表达成纤维细胞特有的波形蛋白，呈绿色荧光，DAPI染料可非特异性地染色细胞核，呈蓝色。以成纤维细胞系NTH3T3为阳性对照，3T3细胞也

表达波形蛋白，但表达强度有所降低。

3)小鼠成纤维细胞流式细胞术鉴定结果

小鼠皮肤成纤维细胞会特异性地在细胞内表达波形蛋白，因而利用兔抗小鼠波形蛋白单抗和FITC标记羊抗兔荧光抗体，经细胞胞内染色后行流式细胞术即可对分离的小鼠成纤维细胞表达波形蛋白情况进行定量分析。结果发现：与加FITC标记羊抗兔荧光抗体的细胞比较，分离培养的成纤维细胞波形蛋白表达阳性率达13.33%，作为阳性对照的NIH3T3细胞波形蛋白表达阳性率为28.11%。以细胞平均荧光密度测定成纤维细胞波形蛋白的表达情况，分离的成纤维细胞平均荧光密度为9.89，而阳性细胞NIH3T3波形蛋白平均荧光密度则为14.16。

相关研究

有研究观察抗CD95的锤头状核酶对新生小鼠皮肤成纤维细胞CD95表达及其凋亡的影响。方法　采用胶原酶消化法分离新生小鼠皮肤成纤维细胞，并构建了针对CD95mRNA的锤头状核酶，经钠米载体Effectene将其转染至成纤维细胞。通过RTPCR、流式细胞仪检测成纤维细胞上CD95表达:细胞经抗CD95抗体(JO2)作用后，通过Caspase3活性检测试剂盒测转染前后细胞Caspase3活性的变化:MTT法测细胞的增殖:AnnexinⅤ凋亡检测试剂盒测细胞凋亡。结果　新生小鼠皮肤成纤维细胞上表达CD95，抗CD95核酶能显著降低细胞表面CD95水平:细胞与抗CD95抗体孵育后，与空白对照和空载体转染组相比，核酶转染组细胞Caspase3活性和凋亡率明显降低，转染核酶的细胞增殖活性显著增强。结论　抗CD95核酶能显著降低新生小鼠皮肤成纤维细胞上CD95表达，使其免于CD95途径的凋亡，为提高皮肤移植物存活提供了实验依据。

此外，还有实验研究林蛙皮活性多肽对小鼠皮肤成纤维细胞增殖作用。方法用传代培养的小鼠皮肤进行成纤维细胞实验，分为空白对照组(正常成纤维细胞+DEME培养液)和增殖实验组(正常成纤维细胞+含林蛙活性肽组分的培养液)，采用MTT法观察两组细胞12、24、36和48h后的生存活性。结果实验组细胞生存活性明显高于对照组(P<0.05)。结论林蛙皮活性多肽对培养的小鼠皮肤成纤维细胞具有明显的增殖作用。

主要参考资料

[1] 运动解剖学、运动医学大辞典

[2] 新生小鼠皮肤成纤维细胞的分离培养与鉴定

[3] 锤头状核酶调控CD95介导小鼠皮肤成纤维细胞凋亡

[4] 林蛙皮活性多肽对小鼠皮肤成纤维细胞增殖的影响