小鼠脑微血管内皮细胞的体外培养

背景及概述^[1]

内皮细胞系指血管、淋巴管的内膜上皮将内腔面覆盖的细胞。多数是单层扁平上皮属中胎叶性的上皮。血液循环和组织中大单核的游走的吞噬细胞有人认为是来自增生的血管内皮。小鼠淋巴管内皮细胞分离自淋巴管组织；淋巴管由毛细淋巴管汇合而成。其形态结构与静脉相似，但管径较细，管壁较薄，瓣膜较多且发达，外形呈串珠状。脑微血管内皮细胞不仅是构成血一脑屏障的主要成分，而且在脑的物质代谢、纤溶与止血、炎症与免疫等方面发挥特殊的作用。由于体外培养的脑微血管内皮细胞保持了较多的体内固有的特点，因此，脑微血管内皮细胞体外培养模型已被广泛用于心脑血管疾病的病理生理、药物筛选及药理学等相关领域的研究。自从首次分离培养大鼠微血管内皮细胞以来，脑微血管内皮细胞分离与原代培养技术被用于相关研究领域。为了使体内与体外实验研究以同一种系动物作为研究对象，有研究借鉴已报道的大鼠和小鼠脑微血管内皮细胞分离和原代培养方法，主要对两种方法进行了比较和改进，成功地进行了小鼠脑微血管段分离和内皮细胞原代培养，获得了纯度较高的小鼠脑微血管内皮细胞。

体外培养^[2]

方法1：小鼠颈椎脱臼处死后，浸泡于75%乙醇3~5min，断头置于无菌的培养皿中，无菌打开颅腔，取出全脑置于盛有冷PBS的培养皿中，去除小脑、间脑(包括海马)之后，将大脑置于无菌的滤纸上轻轻滚动，以除去软脑膜及脑膜的大血管，之后将分离好的脑组织置于新的冷PBS中，再用细解剖镊将残余的软脑膜、软脑膜上的大血管、大脑白质等去除干净，保留大脑皮质，用PBS洗3遍，加人1mlDMEM培养液，用虹膜剪将其剪成1mm3大小，加人0.1%H型胶原酶(含30U/mlDNasel，0.5ml大脑)混匀后置于37aC水浴1.5:-2h，室温中离心，1000r/min，8min，弃上清液；加入巧%葡聚糖悬浮混匀后4℃离心，4000r/min，20min，小心吸去中上层神经组织及大血管，保留底部沉淀物(含脑微血管段)；加人2ml0.1%胶原酶/分散酶(含20U/mlDNasel)悬浮混匀后370℃水浴1.5-2h，室温中离心，1000r/min，8min，弃上清液(此处省去原方法中50%Pere0ll密度梯度离心)；沉淀用DMEM洗2次，室温中离心，1000r/min，5min，弃上清液，加人DMEM完全培养液悬浮后接种于涂布有1mg/mlVI型胶原和纤连蛋白的6孔或者24孔的一次性塑料培养皿，置于37℃、5%C()：培养箱内静置培养，12-24h换液1次，随后每天观察，隔天换液。

方法2：分离小鼠大脑皮质的过程同方法1，将剪碎的脑组织放人无菌的玻璃匀浆器中上下抽动3次，通过0.25mm的尼龙网过滤，收集过滤液，加人15%葡聚糖悬浮混匀后4℃离心(4000r/min，15min)，弃上清液，取沉淀物加人15ml0.1%胶原酶/分散酶(含有2%FBS，30U/mlDNasel)置370C水浴6h(中间伴有轻微的摇动)，室温中离心(1000r/min，5min)，弃上清液(此处省去原方法中45%Pere0ll)，沉淀物用2mlDMEM洗l次(1000r/min，5min)，弃上清液，加人DMEM完全培养液，以后步骤同方法1。

结果：采用两种方法分离的脑微血管段于接种当时，均可见由圆形的内皮细胞构成的呈单支状和分支状的脑微血管段，并可见散在的单细胞及组织碎片(图IA、IE)；培养12h时可见培养的内皮细胞从贴壁的微血管段周围爬出(图IB、I)F；培养至第3一5日，可见内皮细胞不断增殖，细胞呈短梭形，区域性单层生长(图IC、ID、IG、IH)；培养至第7日时，内皮细胞生长呈“漩涡状”，可见各处细胞汇合生长(图2)；培养至第5~7日的脑微血管内皮细胞用免疫荧光法鉴定姗因子相关抗原，于荧光显微镜下观察，90%以上呈阳性。

相关研究^[3]

有试验研究辅酶Q10抑制血管内皮细胞凋亡和增殖的作用及其可能机制。方法：用血清药理学方法和流式细胞仪法检测体外培养的小鼠脑微血管内皮细胞(bEnd.3)中不同浓度C0Q10对细胞凋亡和增殖的变化。用免疫细胞化学ABC法观察Fas蛋白及Bcl-2蛋白表达的变化。结果：与对照组比(加不含药血清)，在bEnd.3细胞培养中加入50μL、25μL、125μL含C0Q10的血清组细胞凋亡明显抑制(P005)。免疫细胞化学检验结果证明，此时Fas蛋白表达明显减弱，而Bcl-2蛋白表达明显增强(P005)。但C0Q10对细胞增殖影响不显著。

此外，还有实验研究无血清培养诱导小鼠脑微血管内皮细胞凋亡及其可能机制。方法培养用小鼠脑微血管内皮细胞系bEnd.3。用流式细胞术检测凋亡细胞的百分比；用免疫细胞化学法检测Bax及Bcl-2蛋白表达；用WesternBlot检测caspase3蛋白表达。结果bEnd.3细胞经无血清饥饿体外培养12，24，36h后细胞凋亡率明显增加，分别为(13.79±0.99)%，(17.80±1.39)%，(20.51±0.55)%，与各自正常血清培养的对照组凋亡率相比，P0.01。Bax表达明显增强，Bcl-2表达明显减弱，caspase3明显增强。

主要参考资料

[1]现代药学名词手册

[2]小鼠脑微血管内皮细胞的原代培养与纯化

[3]辅酶Q-(10)对体外培养的小鼠脑微血管内皮细胞凋亡和增殖的影响

[4]无血清培养对小鼠脑微血管内皮细胞凋亡的影响及其机制