常见兽用免疫佐剂

免疫佐剂（immunoadjuvant）就是指先于抗原或与抗原同时应用，能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答，能增强相应抗原的免疫原性或改变免疫反应类型，而本身无抗原性的物质。随着亚单位疫苗、合成肽疫苗、核酸疫苗、抗独特性抗体疫苗等各种新型疫苗的出现，免疫佐剂的研究也越来越被人们关注，临床应用也越来越广泛。这些新型疫苗虽然具有抗原性良好、毒性低等优点，但因其免疫原性低，需要配合高效免疫佐剂的使用。免疫佐剂是一类可以先于抗原或与抗原同时使用，能够非特异地增强机体对抗原的特异性免疫应答反应，而自己本身并无抗原性的物质。对于很多传染病，因缺乏合适的佐剂而影响重组蛋白、多肽、菌苗、DNA疫苗、毒苗等的发展。因此，对于传染病的防控不仅是研发高效低毒的疫苗，免疫佐剂的研发也至关重要。
本文介绍了免疫佐剂的作用机理以及各种免疫佐剂的应用概况，以期为研发低毒、高效的兽用佐剂提供参考。

1.免疫佐剂的作用机理

一般的说，不同佐剂具有不同的效应机制。1996年，关于免疫佐剂作用机制Gill等提出2-信号假说，根据该假说，Th细胞的起始反应需要3个信号，分别是信号0、信号1和信号2，理论上，佐剂可以与这3个信号都作用，根据启动不同信号通路发挥作用，将佐剂分为A型、B型和C型佐剂，见图1。A型佐剂是目前研究最多的，如单磷酰脂质A（MPL），主要与信号0发生作用，通过激活抗原递呈细胞（APCs）间接与信号2作用，引起细胞因子的分泌。B型佐剂，是非特异性佐剂，如铝氢氧化物，通过在注射部位建立一个中转站，从而增强抗原的递呈作用，最终使局部抗原浓度增大，并通过APCs提高上调作用，它们的效应基于信号1的放大。C型佐剂，它们的功能模式是通过与APCs上的共同刺激分子相互作用，引起信号2的增强。

免疫佐剂除了可以增强机体对该抗原的特异性免疫应答，在疫苗免疫中还起到储存抗原的作用，还可以影响递呈抗原的树突状细胞（dendriticcells，DC），提高免疫应答和有效的记忆性免疫。在机体中，DC通过监测免疫环境来识别坏死细胞、受伤机体释放的细胞因子和细菌等危险信号。上述这些危险信号都能激活DC，促进带有相应受体的淋巴细胞通过淋巴管从淋巴结中迁移出来而产生初次免疫，有些免疫佐剂能够诱导机体不同类别细胞因子的分泌，从而控制或者改变机体对该抗原的免疫反应类型。

图1  佐剂作用机制

2.免疫佐剂的类型

2.1 天然来源佐剂

从天然植物中提取的某些成分经过研究发现该成分具有免疫佐剂的活性，因为具有来源天然、毒性较低、代谢容易、不易产生耐药性等优点，近年来在免疫佐剂的研究中越来越被重视。

2.1.1 QuilA

QuilA是从南美皂树树皮中筛选到的具有佐剂活性的成分。大量研究表明其为既能使外源性抗原刺激机体Th1免疫应答，又能诱导CTL应答的佐剂。这一独特的性质使其成为亚单位疫苗、细胞内病原体疫苗及癌症疫苗的理想佐剂。但是QuilA存在严重的毒副作用，可引起溶血、局部组织坏死，甚至全身不良反应或中毒，其对小鼠致死量为100~125μg。研究表明QuilA 除了用于为某些绝症设计的疫苗如癌症疫苗和人免疫缺陷病重组疫苗等人用疫苗外，仍主要限用于口蹄疫疫苗和狂犬疫苗等兽用疫苗。2013年靖杰等以QuilA为佐剂的H1、H3亚型流感病毒多表位DNA疫苗免疫小鼠，进行细胞免疫和体液免疫水平检测，结果表明，该佐剂可诱导免疫小鼠产生特异性的体液和细胞免疫应答。2010年刘燕瑜等在猪O型口蹄疫疫苗添加QuilA佐剂，显著提高了FMD疫苗免疫后猪VP1结构蛋白抗体及血清中细胞因子的水平，显著提高了T淋巴细胞增殖率，从而提高了对猪的免疫保护作用。

2.1.2 皂甙

天然植物中提取的皂甙（Saponins）也具有佐剂活性。研究发现其能够与细胞膜上的胆固醇形成复合物，是抗原强有力的免疫佐剂。皂苷佐剂不仅可以促进T、B淋巴细胞增殖，提高NK细胞的杀伤活性，增强巨噬细胞吞噬能力及其代谢功能；而且还可诱导产生特异性MHC-I抗原限制性CTL，并刺激分泌多种细胞因子，如IL-10、IL-4、IFN-γ、IL-2、IL-8、TNF-α；此外还可提高动物机体对抗原的特异性抗体水平，并刺激产生IgG1、IgG2a和IgG2b抗体亚类。2010年曹发昊等制备O/W人参皂甙纳米乳，其稳定性良好，能增强机体对抗原的抗体产生能力，同时增强Th1和Th2免疫应答反应。研究还表明皂甙对猪丹毒疫苗、奶牛金黄色葡萄球菌疫苗、猪细小病毒疫苗、鸡新城疫疫苗、禽流感疫苗和口蹄疫疫苗均有显著的佐剂作用，并且主要增强IgG2免疫反应。

2.1.3 蜂胶

蜂胶是一种具有广谱生物学活性的天然物质，包含树脂类化合物、多酚类化合物和多糖类化合物等，是一种天然的免疫增强剂。应用蜂胶或配合抗原引入机体，既能引起特异性免疫应答，又能启动非特异性防御机制，能刺激免疫系统增加抗体产量，增强补体活性和吞噬细胞的能力。蜂胶佐剂疫苗保护率比铝佐剂疫苗高出22%，接种后无不良反应。蜂胶可以显著提高CD4+T 细胞、CD8+T 细胞数量和血清中IL-4含量。鉴于蜂胶佐剂无副作用，免疫效力高，禽霍乱蜂胶疫苗在我国已试用推广到全国30 多个省市区。2010年张旭研制出复方蜂胶纳米乳佐剂-H9亚型禽流感灭活疫苗，结果表明，能诱导机体产生高的抗体水平，并能激活机体的细胞免疫应答，与油苗比较，免疫后产生抗体时间更早、滴度更高、细胞免疫水平高。沈志强等用蜂胶作为佐剂研制新城疫-减蛋综合征蜂胶二联灭活疫苗，结果表明，免疫后5天，新城疫和减蛋综合征抗体效价都增强了，较传统油苗提前了10天。还有以蜂胶作为佐剂研制的其他禽类和猪用疫苗，结果表明都能引起一个较早、较持久和强的免疫保护。

2.2 油乳佐剂

油乳佐剂可以使单一或者多种抗原产生高滴度抗体且免疫周期较长，包被在油滴中的特异性抗原释放缓慢，能连续刺激机体产生特异性免疫应答；油滴能诱发机体局部产生炎症反应，有利于刺激免疫细胞的增殖，增强体液和细胞免疫应答；特异性抗原包被在油滴中，避免被体液中的酶迅速分解，降低抗原分解速度，延长作用时间；油乳剂能将注射部位的特异性抗原经淋巴系统运送至全身的淋巴结和脾脏处，从而产生一种新刺激诱生抗体。

2.2.1 根据油料分类

根据油料的不同，油乳佐剂可以分为矿物油佐剂和非矿物油佐剂两种。矿物油佐剂是将矿物油、乳化剂（如Span-80、Tween-80）及稳定剂（如硬脂酸铝）按一定比例混合制备而成的，主要包括弗氏佐剂、白油司本佐剂和ISA206等，其特点是不稳定且粘稠、在体内不能被代谢，毒副作用巨大；非矿物油佐剂的油料成分是花生油、角鲨烷、角鲨烯等可代谢物质，主要包括MF-59、佐剂-65和SAF系列等。MF59是以5%角鲨烯、0.5% Tween80和0.5% Span85组成的油包水纳米油乳佐剂，它能在注射部位诱导局部免疫刺激，调节细胞因子、趋化因子和其他固有免疫基因，促进树突状细胞对抗原的摄取，诱导偏向Th2型免疫应答，已应用到流感亚单位疫苗中。佐剂-65是以花生油为基础油相制成的W/O型佐剂，它能在注射部位形成油囊包后2~3个月消失，没有潜在的致癌物质。Woodhour等进行长期动物实验表明，除了注射部位的反应外，并没有引起其他病变，也没有致突变性。

2.2.2 根据分散状态分类

根据分散状态的不同，可以将油乳佐剂分为水包油（O/W），油包水（W/O），水包油包水（W/O/W）三种类型，O/W型乳状液安全性较高，但扩散快，使得佐剂活性较低；油包水（W/O）型乳状液能在注射部位贮存时间较长，能给抗原提供短期及长期的免疫增强作用，佐剂活性很高；双相型（W/O/W）乳状液的作用时间和活性都介于两者之间，但稳定性较差，容易转化为W/O 型。影响乳化剂稳定性的因素也有很多，比如亲水亲油平衡值（HLB）、乳化工艺等，将低和高HLB值的乳化剂混合使用能产生特别稳定的界面膜，从而形成比较稳定的乳化体系。油乳佐剂作为一个贮存库，可以防止水相中的多肽被机体水解，从而达到缓释和保护抗原的目的，油水乳剂有利于树突状细胞移向淋巴细胞并递呈，以增强机体的免疫应答反应。

图2 油乳佐剂

2.3 细胞因子免疫佐剂

细胞因子（Cytokines，CK）是一类存在于人和高等动物体中的由白细胞和其他细胞合成的异源性蛋白或糖蛋白，分子量约20kDa，一般以小分子分泌物形式释放，可结合在靶细胞的特异受体上。目前研究发现的具有免疫佐剂效应的细胞因子有白细胞介素-2（IL-2）和干扰素（IFN）等。

2.3.1 白细胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）

IL-2可引起T细胞增值和维持T细胞在体外的持续生长，故曾称为T细胞生长因子。IL-2作为免疫佐剂可作用于多种免疫细胞，如包括T、B淋巴细胞、巨噬细胞和NK细胞等，对免疫应答具有广泛的上调作用。IL-2除诱导外周T细胞增值及抑制T细胞凋亡外，还具有刺激胸腺产生T细胞的作用。2013年Hu等研究发现IL-2能有效地增强小鼠骨髓细胞成熟，故IL-2可作为以树突状细胞（DC）为基础的疫苗佐剂。2011年Zhang等在口蹄疫病毒的模式抗原中，联合IL-2和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子作为VP1重组蛋白的佐剂，结果表明联合佐剂的使用可刺激体液和细胞免疫反应，与各佐剂单独免疫相比具有更好的佐剂作用。

2.3.2 干扰素（Interferon，IFN）

IFN的免疫佐剂活性主要表现在抗病毒、免疫调节、抑制细胞分裂及抗肿瘤等方面。IFN具有广谱的抗病毒作用，使病毒增值量减少，细胞损伤程度降低，其抗病毒活性较高。另外，IFN还能增强T细胞、B细胞和NK细胞的活性。IFN分子量小，可以自由出入细胞，作用无特异性。它能抗御各种病毒，但却不能直接作用于病毒，而是促使宿主细胞阻止病毒生长。当病毒进入细胞内时，IFN可以促使细胞产生一种抗病毒蛋白质（Antiviralprotein，AVP），此物质可以有效地阻止宿主细胞为病毒译制病毒蛋白质，从而达到抗病毒的作用。IFN的抗病毒作用非常明显，只要细胞内有IFN存在，一切病毒都不能增殖。2008年Cheng等在鸭瘟病毒弱毒疫苗中构建IFN-α真核表达质粒，在注射疫苗前15d注射该表达质粒，能显著诱导机体的细胞免疫，结果表明该表达质粒是鸭瘟弱毒疫苗优良的分子佐剂。另外，研究表明，IFN-α在对丙肝治疗效果显著。

2.4 新型免疫佐剂

2.4.1微生物来源佐剂

某些菌体及其成分、代谢产物等配合抗原可以起到明显的佐剂作用，这类佐剂主要有革兰氏阴性菌的脂多糖（LPS）、分枝杆菌及其组成成分、革兰氏阳性菌的脂磷壁酸、革兰氏阳性菌、短小棒状杆菌、酵母菌的细胞壁、白色念珠菌提取物、细菌的蛋白毒素（霍乱毒素、破伤风毒素、白喉类毒素）、CpGDNA等。目前，多项微生物和肿瘤抗原的后期临床试验正在进行中，其在人医上的安全性已得到证实。

2.4.2免疫刺激复合物

免疫刺激复合物（IS⁃COMs）是瑞典科学家Morein等在20世纪80年代研发的一类作为抗原传递系统的佐剂，它是由脂类、胆固醇、抗原及糖苷Quil-A组成的笼状结构，可通过表面疏水作用捕获蛋白抗原，通过内吞作用被APC摄取。用免疫刺激复合物技术来制备各种兽用的细菌、病毒和寄生虫疫苗已有大量研究，适用于豚鼠、猪、牛、狗、兔和绵羊等多种动物，可以介导广泛全面的免疫反应，具有较强的免疫原性和安全性。

图3 免疫刺激复合物

2.4.3 脂质体佐剂

脂质体是由一层或数层同化圆排列的连续脂质分子组成的内含水相空间而形成的，其成分主要是天然形成的磷脂，如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺，也含有胆固醇、硬脂酸胺、磷脂酸和二酰基磷酸等成分，磷脂的酰基链越长饱和程度越高，则佐剂性越强。脂质体兼具佐剂和载体功能，类似细胞膜的微球体，能将抗原传递给合适的免疫细胞，具有靶向作用，脂质体可以说无毒、无免疫原性，且在体内能降解，是一种良好的佐剂。李成文等研究发现空肠弯曲菌外膜蛋白亚单位脂质体佐剂疫苗，能显著提高血清抗体水平。脂质体作为新型疫苗的佐剂也很成功，张静等将轮状病毒DNA 疫苗与脂质体结合免疫小鼠后，血清IgA水平明显升高。纳米正电荷脂质体将能顺应疫苗研究的发展方向，有助于提高蛋白质疫苗和基因疫苗的细胞免疫效应。

2.4.4 纳米佐剂

纳米佐剂是用纳米级的粒子材料制成的佐剂。目前应用于佐剂领域的纳米材料包括氢氧化铝、磷酸钙和壳聚糖等等。纳米材料具有比表面积大，吸附催化能力强等特点。与抗原结合后免疫动物，可以提高抗原递呈细胞对抗原的摄取、加工和提呈能力；诱导抗原通过MHC-I途径产生CD8+T细胞免疫应答；还可以促进组织细胞释放细胞因子来增强细胞免疫应答。氢氧化铝纳米佐剂均匀性好，可以增强巨噬细胞和树突状细胞摄取抗原能力，为实现有效的免疫应答奠定了基础。Fifis等通过大量的动物试验证明，羧化聚苯乙烯纳米球吸附抗原后免疫动物，主要诱导产生CD8+T细胞免疫应答。宋永焕等发现壳聚糖纳米颗粒可以刺激小鼠脾细胞分泌IL-2和IFN-α，从而引起细胞免疫应答。

3. 展望

免疫佐剂是生物反应调节剂中的免疫调节剂，非特异性免疫刺激作用是使机体产生保护性免疫应答所必需的基本条件。随着对油乳佐剂的深入研究，佐剂成分中矿物油的含量已降至很低，很大程度上降低了油乳佐剂中矿物油和多环芳烃的残留而造成的潜在的安全性问题。选择可代谢油取代传统的矿物油来制备更为安全、稳定、有效的新型免疫佐剂是目前油乳佐剂研究的方向。理想的佐剂应该是广谱的，对动物机体的细胞或体液免疫均有有效的激发作用、作用持久稳定、免疫次数减少、副作用小或无副作用，同时便于生产和易于注射。寻找高效低毒的新型免疫佐剂，通过多种途径开发出低价、高效、安全性高、作用时间长、副作用小、抗原释缓能力强新型佐剂以及其作用机理，是今后免疫佐剂的研究趋势。