IMDM液体培养基的应用

背景及概述^[1][2]

IMDM(Iscove’s Modified Dubecco’s Medium ) 又称为伊思柯夫改良培养液含有L-谷氨酰胺4.00mM；HEPES缓冲液25mM；不含α-硫代甘油；不含碳酸氢钠；含酚红。主要用于培养hybridoma cell lines ，macrophages，HUT78等细胞，并且这些IMDM培养的细胞同样也可以用RPMI-1640培养。

应用^[1-2]

一、用于表达狂犬抗体的CHO细胞无血清悬浮培养方法

表达狂犬抗体的 CHO细胞无血清悬浮培养方法，包括以下步骤：

(1)细胞株的培养：所述细胞株为中国仓鼠卵巢细胞，且以下简称为细胞；将细胞 以2×105～6×105cells/ml的数量接种于血清培养基，培养条件为37℃，5.0％二氧化碳的 培养箱，得到细胞A；测定细胞A的生长曲线以及加入微量的促生长因子后细胞A的生长曲 线；所述促生长因子为促生长剂G-CSF-RCHP，且按0.2～0.4μL/ml添加至血清培养基；

 (2)细胞的收集：将生长于血清培养基中的细胞A，使用胰酶处理1～5min后，收集 细胞A于15ml的离心管中，1000rpm离心3min，吸入37℃预热的10ml无血清培养基溶液洗涤 细胞一次，最终定容于体积5ml的无血清培养基中，得到细胞B，并采用Trypan Blue染色计 数细胞B，测定细胞B的数量；

(3)6孔板的预处理：取pH值为7.0～7.2的1×BS溶液，稀释浓度为1mg/ml的纤维链 接蛋白，得到最终工作浓度为20～80μg/ml的混合溶液，再吸取1ml混合溶液加入6孔板，处 理时间为15～60min，即得到预处理6孔板；

(4)细胞培养：将细胞B按2×10⁵～6×10⁵cells/ml的数量接种预处理6孔板中，再将细胞B依次在含有5％胎牛血清的IMDM液体培养基、含有2.5％胎牛血清的IMDM液体培养基、含有1.25％胎牛血清的IMDM液体培养基、含有0.1％胎牛血清的IMDM液体培养基中逐代培养，当细胞B充满贴壁生长或经隔夜培养生长后，即可替换为上述胎牛血清比例逐步减少的IMDM液体培养基，直至替换为无血清培养基；同时通过显微镜观察经过隔夜培养的细胞B 的形态，并根据细胞B生长的状态情况，当细胞B由贴壁生长逐渐转换为悬浮生长，且细胞形 态由弧形或梭形转换为圆形，将悬浮的细胞B转接未经预处理的6孔板继续培养，最终从生长的细胞B中筛选悬浮细胞，并对筛选出的悬浮细胞抗体表达进行检测。

二、用于诱导性多能干细胞向造血干细胞分化的方法及其培养基

诱导性多能干细胞向造血干细胞分化的方法，包括如下步骤：

S1.将诱导性多能干细胞(具体可为人源、皮肤成纤维细胞)进行预处理；预处理的 目的是提高细胞的活性和分化能力；

S2.收集经步骤S1预处理后的诱导性多能干细胞，用添加了重组来源的细胞因子 组合Ⅰ的改进拟胚体形成培养基悬浮后离心，将离心后聚集在一起的诱导性多能干细胞在 所述添加了重组来源的细胞因子组合Ⅰ的改进拟胚体形成培养基中培养，获得拟胚体；

S3.收集步骤S2获得的拟胚体，用添加了重组来源的细胞因子组合Ⅱ的造血干细 胞诱导培养基培养，获得造血干细胞。

在上述诱导性多能干细胞向造血干细胞分化的方法中，步骤S3中，所述造血干细胞诱导培养基包含如下组分：

IMDM液体培养基90-95％(体积百分含量)；

热灭活人AB血清4-5％(体积百分含量)；

L-丙氨酰-L-谷氨酰胺2mM；

胰岛素-转铁蛋白-硒10ug/ml；

肝素钠2IU/ml；

铁离子饱和人转铁蛋白10ug/ml。

主要参考资料

[1] CN201810177693.X 表达狂犬抗体的CHO细胞无血清悬浮培养方法

[2] CN201710422772.8 诱导性多能干细胞向造血干细胞分化的方法及其培养基