对HCT 116/人结肠癌细胞的相关研究

概述^[1]

HCT 116的培养条件：37℃，5%CO₂，CM2-1 培养液。CM2-1 培养液：90%RPMI-1640+10%FBS。RPMI-1640：1640 培养基，含谷氨酰胺。复苏步骤：①新制 100mm 平皿 1 个，含 12mL 上述培养液；②冻存管从液氮或-80℃中取出，37℃水浴 1~2min,待完全溶解后尽快移入安全柜复苏；③用无菌吸管吸取溶解液打入新制平皿中，顺时针摇匀；④放入（37℃，5%CO₂）培养箱中，过夜换液，2-4 天长满。传代/冻存：将旧培养液吸除，PBS 清洗两遍后，加入 6mL（/100mm 皿）胰酶，在显微镜下观察，期间禁止摇晃培养皿，细胞刚有脱落时，则吸除大部分胰酶，留约 0.5mL，移至培养箱消化，约 2min 取出。传代用 12mL CM2-1 培养液终止消化，轻轻吹打均匀细胞，后可分 3~6 皿培养；冻存则用 6mL 冻存液（90%FBS+10%DMSO）终止消化，吹打均匀，分为 6 支冻存管，用程序降温盒于-80℃冻存。复苏质量记录：根据复苏要求，对以上细胞株进行复苏，记录结果如下：

相关研究^[2-4]

于小鼠右前肢皮下注射HCT116细胞悬液100 μl,对照组注射100 μl PBS,造模第七天后给药,小檗碱低中高给药组分别腹腔单次注射10、20和40 mg/kg小檗碱和生理盐水溶液,阳性药物组小鼠腹腔注射20mg/kg氟尿嘧啶,对照组和模型组腹腔注射相同体积的生理盐水溶液。结果:小檗碱在体外对结肠癌细胞HCT116有抑制作用,半数抑制浓度IC50为0.24μmol/L。

小檗碱给药组（低、中、高剂量），阳性药物组、模型组和对照组于注射后的第1，7，14和21天时小鼠体重的比较，不同时间、不同组间小鼠体重有差别（P<0.05）；6组的小鼠体重变化趋势有差别（P<0.05）。低、中、高剂量小檗碱组小鼠肿瘤体积低于模型组,呈现剂量依赖性改变（P<0.05）。低、中、高剂量小檗碱治疗组和阳性药物组的存活率均高于模型组（P<0.05），且小檗碱治疗组呈剂量依赖性改变。小檗碱治疗组和阳性药物组小鼠肿瘤组织重量均低于模型组（P<0.05）。小檗碱治疗组肿瘤组织中Caspase-9和Caspase-3基因表达高于模型组（P<0.05）；肿瘤组织中Cytochrome C、Caspase-9和Caspase-3蛋白表达水平较模型组升高（P<0.05）。结论:小檗碱通过破坏线粒体释放CytochromeC，进而激活凋亡相关蛋白Caspase-9和Caspase-3的表达，诱导肿瘤组织细胞凋亡，发挥抗肿瘤活性。

设置100、50、25μg/mL莪术醇为高、中、低剂量组,不加药为空白对照组，顺铂5μmol/L为阳性药物组，药物干预24h，采用CCK8法检测不同浓度的莪术醇对结肠癌细胞HTC116的抑制作用，采用FDA染色实验观察结肠癌细胞各组生长状态，Western Blot(免疫印迹)实验检测凋亡蛋白BCL-2、BAX、Caspase9的表达变化。结果：莪术醇能有效抑制结肠癌细胞HCT116增殖。形态学上，空白组生长密集,阳性药物组细胞稀疏，高、中、低莪术醇组分别呈密集到稀疏趋势。在凋亡方面，莪术醇能上调凋亡蛋白BAX、Caspase9的表达，降低抗凋亡蛋白BCL-2的表达。结论：莪术醇能明显抑制HCT116细胞的分化增殖，其机制可能与上调凋亡蛋白BAX、Caspase9的表达,降低抗凋亡BCL-2的表达有关。

选用结直肠癌细胞HCT116，通过转染SIRT1质粒来过表达SIRT1，此为过表达组；通过siRNA来敲低SIRT1，此为敲低组；用MTT法、CCK-8法和克隆形成试验来测定HCT116细胞的增殖和活力情况；通过免疫印迹试验来检测NF-κB通路相关蛋白的表达情况。

结果过表达组中，p-P65、p-IKKalpha的表达量明显降低(P<0.05)，而P65和IKKalpha的总体表达量没有明显差异(P>0.05)，HCT116的生长速度、增殖速率以及细胞活力明显降低(P<0.05)；敲低组中，p-P65、p-IKKalpha的表达量明显上升(P<0.05)，而P65和IKKalpha的总体表达量没有明显差异(P>0.05)，HCT116的生长速度、增殖速率以及细胞活力明显上升(P<0.05)。在过表达SIRT1的同时,用NF-κB的抑制剂Curcumin处理HCT116后，NF-κB通路相关蛋白的表达量以及HCT116的生长速度和增殖速率无明显变化(P>0.05)。结论 SIRT1通过抑制NF-κB的激活来降低结直肠癌细胞HCT116增殖和活力。

主要参考资料

[1] HCT 116/人结肠癌细胞说明书

[2] 李艳,伊航,蔡轶伦,林红艳,刘还秀.小檗碱抑制HCT116细胞在小鼠体内增殖的分子机制研究[J/OL].中国现代医学杂志:1-12[2019-04-05].http://kns.cnki.net/kcms/detail/43.1225.r.20190322.1311.016.html.

[3] 梁乔芳,廖小林,吴洪文.莪术醇对结肠癌细胞HCT116的影响及作用机制研究[J].亚太传统医药,2019,15(02):18-20.

[4] 王福海,张广超.SIRT1通过NF-κB通路调节结直肠癌细胞HCT116增殖和活力[J].解剖学研究,2019,41(01):20-24.