大鼠骨粘连蛋白(ON)Elisa试剂盒的应用

背景^[1-3]

大鼠骨粘连蛋白(ON)Elisa试剂盒是一种用于检测大鼠样本中骨粘连蛋白（ON）水平的实验工具。

以下是关于该试剂盒的一些基本信息：

实验原理：该试剂盒采用双抗体夹心法测定标本中大鼠骨粘连蛋白（ON）水平。通过纯化的大鼠骨粘连蛋白（ON）抗体包被微孔板制成固相抗体，加入待测样本中的骨粘连蛋白（ON），再与HRP（辣根过氧化物酶）标记的骨粘连蛋白（ON）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物。经过洗涤后，加入底物TMB进行显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅与样品中的骨粘连蛋白（ON）浓度呈正相关。最后，使用酶标仪在特定波长下测定吸光度（OD值），并通过标准曲线计算样品中大鼠骨粘连蛋白（ON）的浓度。

大鼠骨粘连蛋白(ON)Elisa试剂盒

大鼠骨粘连蛋白(ON)Elisa试剂盒操作步骤：

实验开始前，各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在37℃溶解）；试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100μl（在使用前一小时内配制），酶标板加上覆膜,37℃反应60分钟。

3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约400μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

4.每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液）100μl，酶标板加上覆膜37℃反应60分钟。

5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

6.依序每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后立即进行检测。

大鼠骨粘连蛋白(ON)Elisa试剂盒结果影响因素：影响ELISA结果测定的因素主要包括标本因素、试剂因素和操作因素。例如，标本的采集、保存和处理方式可能会影响实验结果；试剂的质量和稳定性也会影响实验结果的准确性；操作过程中的温度、时间、洗涤次数等因素也可能对实验结果产生影响。

大鼠骨粘连蛋白(ON)Elisa试剂盒注意事项：在使用大鼠骨粘连蛋白（ON）ELISA试剂盒时，需要注意以下几点：首先，确保实验环境干净、整洁，避免污染；其次，按照说明书的要求进行加样和操作；第三，严格控制实验过程中的温度和时间；第四，及时记录实验数据并进行分析；最后，注意实验结果的解读和判断。

应用^[4][5]

大鼠骨粘连蛋白(ON)Elisa试剂盒可以用于β-磷酸三钙对成骨细胞基因表达的影响及骨粘连蛋白的纯化

从生物学和分子生物学的角度来探讨钙磷降解材料参与构建有生命组织的机制，开展钙磷降解材料生物矿化的生物学。在本实验中，分别用组织块法和酶消化方法从Wister新生乳鼠的颅骨中分离了成骨细胞，并对所获得的细胞用差速贴壁方法进行纯化，并进行碱性磷酸酶染色和钙结节染色，染色后的结果证明两种方法所获得的成骨细胞具有良好的生物学特性。

将成骨细胞和钙磷降解材料混合培养后，显微镜下观察可以发现成骨细胞对β-TCP颗粒有明显的吞噬作用。同时MTT实验分析表明，β-TCP有利于成骨细胞的生长和增殖。将成骨细胞和β-TCP颗粒混合培养一段时间以后，提取成骨细胞的总RNA，运用RT-PCR、PCR手段来检测钙磷材料对成骨细胞相关基因表达水平的影响。合成并设计成骨细胞相关基因的引物，RT-PCR、PCR方法检测结果显示，β-TCP颗粒可以显著促进成骨细胞中与成骨作用相关的基因，如碱性磷酸酶(ALP)mRNA、骨粘连蛋白(ONN)mRNA的表达。由于β-TCP能促进成骨细胞骨粘连蛋白mRNA表达。

因此，为了探讨骨相关蛋白在矿化过程中的作用，将大鼠骨粘连蛋白基因重组到原核表达载体pET28a中，构建了可以表达ONN的pHX201／ONN表达载体。同时将本中心已经构建的大鼠骨粘蛋白表达载体pGEX-KG2／ON，以及新构建的pHX201／ONN表达载体分别插入到大肠杆菌E．coli BL21(DE3)pLyS和R1L菌中进行诱导表达，大鼠骨粘连蛋白(ON)Elisa试剂盒结果发现pGEX-KG2／ON表达载体比pHX201表达载体更有利于骨粘蛋白的表达。并进一步对pGEX-KG2／ON表达载体的表达和纯化条件进行优化，将含有pGEX-KG2／ON表达载体的细菌进行扩增，并将增菌后的菌液通过离心、细菌破碎、硫酸铵分级沉淀、超滤管分离、GST亲和层析柱层析逐步纯化，获得了纯度较高GST融合蛋白。

参考文献

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