联硼酸频那醇酯的检测方法

背景技术

联硼酸频那醇酯是一种常用的医药中间体，同时也是一种基因毒杂质。基因毒杂质是一类可与DNA反应，造成DNA损伤，在很低水平下即可诱发基因突变，并可能致癌的杂质，因此需要严格控制样品中此类杂质的限度。

目前，针对联硼酸频那醇酯的检测方法中多采用液相色谱法，但硼酸酯类化合物中由于含有硼酸酯结构，容易和水、醇类发生水解反应，不同的硼酸酯反应速率不一，液相或者液质的流动相都会用到水或醇类，不利于目标物质的检测。而采用气相色谱法对化合物的热稳定性要求较高，硼酸酯的检测常常由于样品基质的存在导致在进样口气化过程中目标物热稳定性差，使得检测方法存在一定局限性。

检测方法

有鉴于此，本申请提供了一种基于气相色谱的联硼酸频那醇酯的检测方法，可以延长待测物的热稳定性，提高检测方法的准确性和灵敏度。

气相色谱条件：色谱柱：VF-624ms柱（30m×0.25mm，1.4μm）；流速：1.0ml/min；进样体积：1μl；分流模式：分流，分流比4：1；控制模式：恒定流量；载气：He；升温程序：70℃，保持1min；30℃/min升温至250℃，保持3min。

质谱参数：采集类型：MRM，离子源：EI，传输线温度：250℃，四级杆温度：150℃，离子源温度：250℃。

杂质扫描参数：母离子239（m/z），子离子57/85（m/z），驻留时间160（ms），CE15/25（eV）。

供试品溶液配制：称取样品约50mg，置于10ml离心管中，准确加入0.1ml二甲基亚砜，涡旋至样品完全溶解，依次精密加入2ml环己烷、0.2ml超纯水，涡旋1min后，静置分层，取上清液过滤，即得。

检测限溶液配制：精密称取联硼酸频哪醇酯对照品，置于10ml容量瓶中，加环己烷使溶解并稀释至刻度，摇匀，配制对照品储备液。取样品约50mg，置于10ml离心管中，准确加入0.1ml二甲基亚砜，涡旋至样品完全溶解，加入0.02ml 对照品储备液，涡旋振荡，再依次精密加入2ml环己烷、0.2ml超纯水，涡旋1min后，静置分层，取上清液过滤，即得。

标准曲线溶液配制：称取样品约50mg，置于不同10ml离心管中，准确加入0.1ml二甲基亚砜，涡旋至样品完全溶解；分别精密量取0.02ml各标准曲线储备液置于上述离心管中，涡旋振荡，再依次精密加入2ml环己烷、0.2ml超纯水，涡旋1min后，静置分层，取上清液过滤，即得一系列不同浓度标准曲线溶液。

准确度溶液配制：称取样品约50mg，置于10ml离心管中，准确加入0.1ml二甲基亚砜，涡旋振荡至样品完全溶解，加入0.02ml对照品储备液，涡旋振荡，再依次精密加入2ml环己烷、0.2ml超纯水，涡旋1min后，静置分层，取上清液过滤，即得。

（1）专属性：

分别取供试品溶液、100%限度浓度对照品溶液（浓度为316.96 ng/ml）和准确度溶液，按照测试条件进行分析。结果显示，供试品溶液色谱图中未检出目标峰；100%限度浓度对照品溶液色谱图中显示目标峰，且与峰面积大于LOQ的相邻峰分离度均大于1.5；准确度溶液色谱图（如图1所示）中均显示目标峰，且与峰面积大于LOQ的相邻峰分离度均大于1.5；结果均符合规定，该方法专属性良好。

（2）线性：

取标准曲线溶液，按照分析方法进样检测。结果如图2所示，结果表明：在4.75ng/ml~633.93ng/ml范围内，相当于限度浓度的1.5%～200%，联硼酸频哪醇酯峰面积与浓度呈良好的线性，相关系数r不小于0.990，y轴截距绝对值与100%限度浓度响应值之比为0.2%，线性符合规定。

（3）检测限：

取检测限溶液分别连续进样3次，记录色谱图。结果表明：连续3针检测限溶液中联硼酸频哪醇酯浓度为2.38ng/ml，相当于限度浓度的0.75%，S/N在7.6~10.9范围内，方法检测限结果符合规定。

（4）准确性：

取准确度溶液，按照测试条件分别进样3次进行分析，记录色谱图并计算回收率结果。100%限度浓度共3份加标供试品溶液中联硼酸频哪醇酯的回收率范围为89.0%～104.5%，回收率的RSD（n=3）小于6%，准确度结果符合规定。

（5）稳定性：

分别取供试品溶液、100%限度浓度对照品溶液和准确度溶液于室温条件下放置不同时间，按照分析方法进样分析，记录色谱图。于室温条件放置11.5h，供试品溶液均未检出联硼酸频哪醇酯；100%限度浓度对照品溶液中联硼酸频哪醇酯的检测浓度与初始（0h）检测浓度的比值介于88.4%~92.3%之间；准确度溶液中联硼酸频哪醇酯的检测浓度与初始（0h）检测浓度的比值介于86.4%~88.3%之间；因此，供试品溶液、100%限度浓度对照品溶液和准确度溶液于室温条件下放置至少11.5小时内稳定。

参照实施例1的气相色谱和质谱条件对准确度溶液进行采样分析，区别仅在于准确度溶液配制中，先采用等量丙酮溶解样品，再加入2ml环己烷、2ml超纯水涡旋，其他条件均不变。结果见图3所示，待测物出峰时间7.744min，回收率约87%，但在5个小时后回收率跌至60%，稳定性不符合要求。