T7表达感受态细胞的应用

背景及概述^[1][2]

大肠杆菌经Ca离子处理后可摄取外源DNA(Plasmid、Phage DNA)，处于这种状态的细胞称作感受态细胞(Competent Cells)。T7 Express菌株为大肠杆菌BL21增强型菌株，为Lon和OmpT蛋白酶缺陷型，主要适用于含有T7启动子的原核表达载体(如pET等)的蛋白表达，同样适用于需要大肠杆菌RNA聚合酶来转录RNA的非T7启动子的表达载体（如pGEX等）。该菌株区别于BL21(DE3)菌株的优势在于T7 RNA聚合酶基因整合在细菌染色体上的lac操纵子区域，基因组中无λ前噬菌体序列，并具有抗T1噬菌体感染等特点。T7表达感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率大于10的8次方cfu/μg DNA。产品特点:对氨苄青霉素，卡那霉素，壮观霉素，氯霉素，链霉素和四环素敏感。

应用 ^[2]

CN201710375132.6提供一种脂肪酶重组大肠杆菌表达菌株，由下述方法制得：

(1)将脂肪酶GZEL基因克隆到pFL-B62cl表达载体上，构建得到重组质粒；所述脂肪酶GZEL基因的碱基序列如SEQ ID NO:2所示；

(2)将所得的重组质粒转化大肠杆菌Shuffle T7感受态细胞，挑选阳性克隆，获得重组大肠杆菌表达菌株。

CN201710375132.6提供一种重组脂肪酶，以上述获得的重组大肠杆菌表达菌株为发酵菌株进行液体发酵，制备重组脂肪酶。

所述的重组脂肪酶的制备步骤如下：

(1)将重组大肠杆菌表达菌株接种于含氨苄青霉素的LB液体发酵培养基中，于37±2℃，摇瓶培养至对数生长期，制备种子液；

(2)将所述种子液按5～10％的接种量接种到LB液体发酵培养基中，于37±2℃，摇瓶培养至OD600＝0.6～0.8，再添加IPTG至终浓度10mM，于20℃，摇瓶条件下诱导培养；

(3)将步骤(2)中所得发酵液离心，收集菌体沉淀，用磷酸盐缓冲液(pH7.0)重悬并超声破碎细胞，将细胞破碎液离心，取上清，即为重组脂肪酶粗酶液。

所述LB液体发酵培养基成分为：NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L， pH7.2～7.4。所述的纯化方案中，镍柱亲和层析所用的洗脱缓冲液为含有150mM咪唑的磷酸盐 缓冲液(pH7.0)。DEAE层析中所用的洗脱缓冲液为含有200mM NaCl的磷酸盐缓冲液(pH7.0)

所述重组脂肪酶在植物毛油脱胶中的应用，具体包括如下步骤：

(1)将植物油毛油水浴加热至80℃，加入45％柠檬酸，进行均质处理；

(2)将(1)中处理完的毛油冷却至30～60℃，加入NaOH溶液调节体系pH在4～7之 间；

(3)按400～2000U/kg植物毛油的比例加入重组脂肪酶，再加入蒸馏水，酶液和蒸 馏水的总体积占油重的2％～5％，混合均匀；

(4)在搅拌条件下，30℃～60℃水浴反应，反应时间为0.5～4h；

(5)将脱胶体系升温至70～100℃灭活酶，离心，保留上层油样，完成脱胶。

步骤(1)所述均质处理的条件为：10000r/min均质1min，80℃水浴、500r/min机械 搅拌下维持20min。

本发明具有如下优点和有益效果：

(1)相比较于已报道的对于该酶的真核酵母重组表达方法，大大节约了生产成本， 提高了效率。

(2)本发明采用重组大肠杆菌所产脂肪酶GZEL作为催化剂，酶蛋白发酵工艺简单且成本低；利用该酶进行植物油脱胶可在较低温度下实现与传统商品化脱胶用酶Lecitase Ultra同等的脱胶效果，在降低能耗方面优势明显。

主要参考资料

[1] T7表达感受态细胞说明书

[2] CN201710375132.6 一种脂肪酶重组大肠杆菌表达菌株、重组脂肪酶和应用