DH10BAC 感受态细胞的应用

背景及概述^[1]

大肠杆菌经Ca离子处理后可摄取外源DNA(Plasmid、Phage DNA)，处于这种状态的细胞称作感受态细胞(Competent Cells)。DH10Bac感受态主要用于生产重组杆状病毒分子（Bac-to-Bac杆状病毒表达系统）。DH10Bac菌株中含有父本杆粒 bMON14272 、辅助质粒 pMON7124 ：父本杆粒 bMON14272包含 mini-F复制子, 卡那抗性基因, attTn7 位点和 lacZα互补因子；辅助质粒 pMON7124 含有 tnsABCD区（tnsABCD region supplies the transposition proteins required for insertion of the mini-Tn7 from the donor plasmid into its target site on the parent bacmid），具有四环素抗性，在细胞扩增过程中丢失，但可提高供体质粒pFastBac转化后的基因转座效率。

mcrA、mcrBC及mrr突变使DH10Bac菌株适合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA（Therefore , genomic DNA , both  prokaryotic and eukaryotic, can be cloned efficiently in DH10Bac）。recA1和endA1的突变有利于插入DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。φ80dlacZ∆M15 的存在使DH10Bac可用于蓝白斑筛选。

操作方法^[1]

1.DH10Bac感受态细胞放置冰中融化（或放手心或室温片刻，待菌体处于冰水混合状态时迅速插入冰中），加入目 的DNA（质粒或连接产物）并用手拨打EP管底轻轻混匀，冰上静置25分钟。

2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。

3. 向离心管中加入700ul不含抗生素的无菌培养液（2YT或LB），混匀后37℃，200 rpm复苏60分钟。

4. 5000rpm离心一分钟收菌，留取100ul左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。

5.将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。如果进行蓝白斑筛选操作，将平板放37℃培养至少13h。

注意事项^[1]

1. 感受态细胞在冰上融化。

2. 混入质粒或连接产物时应轻柔操作。

3. 转化高浓度的质粒或高效率的连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。

应用^[2-3]

CN201410315228.X公开一种猪流行性腹泻病毒新变异毒株重组S1蛋白及其亚单位疫苗，该蛋白系将含有KDEL3基因序列、缺失III区的铜绿假单胞菌外毒素A基因序列和S1(m)基因序列的融合基因片段PE(△III)-S1(m)-KDEL3克隆至杆状病毒载体中获得重组载体，将所述的重组载体阳转DH10Bac感受态细胞进行重组载体位点特异性转座获得重组杆状质粒，将该重组杆状质粒在脂质体介导下转染Sf9细胞获得重组Sf9细胞，经该重组Sf9细胞表达获得。本发明在对S1基因哺乳动物密码子偏嗜性优化的基础上，首次利用杆状病毒表达系统表达PE(△III)-S1(m)-KDEL3融合蛋白，以期获得正确并高效表达融合蛋白的重组杆状病毒。经IFA和Western blot验证重组杆状病毒可正确表达融合蛋白且融合蛋白具有良好的反应原性。

CN201310701927.3公开了一种对氧磷酶1基因的表达纯化方法，属于基因工程技术领域。本发明的方法是首先扩增对氧磷酶1基因，连接到转移载体pFastBacTMⅠ上构建重组转移载体，转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，获得含有对氧磷酶1基因的重组杆状病毒DNA，将其转染家蚕BmN细胞，复制装配成含对氧磷酶1基因的重组病毒后，接种家蚕五龄幼虫，发病后取蚕血，经离心过滤除杂并经浓缩后用汽巴蓝亲和层析以及抗体亲和层析纯化蚕血，获得对氧磷酶1蛋白。该方法实现了蛋白的高效表达且结构接近天然蛋白，解决了天然PON1含量低、难纯化的问题。

主要参考资料

[1] DH10Bac感受态细胞产品说明

[2] CN201410315228.X一种猪流行性腹泻病毒新变异毒株重组S1蛋白及其亚单位疫苗

[3] CN201310701927.3对氧磷酶1基因的表达纯化方法