SANT-1(Hedgehog/Smoothened拮抗剂)

背景^[1-7]

SANT-1(Hedgehog/Smoothened拮抗剂)是Smoothened(Smo)受体特异性抑制剂。SANT-1直接结合到Smoothened(Smo)受体，Kd为1.2 nM，且抑制smo激动剂作用效果，IC50为20 nM。SANT-1比其他拮抗剂更大程度地降低SAG对Shh-LIGHT2细胞的刺激。SANT-1同等有效抑制野生型和致癌的Smo。SANT-1作用于Shh-LIGHT2细胞，抵消SAG-诱导通路激活SANT-1能够抑制BODIPY-Cyclopamine结合到表达Smo的细胞，但SANT-1不能完全抑制这种关联性。

这说明它们与Smo之间的相互作用，可能会改变其对Cyclopamine的亲和力，而不是直接竞争性结合Cyclopamine。SANT-1作用于SmoA1-LIGHT2细胞，抑制通路激活，在Shh-LIGHT2实验中，也可观察到相似的作用效力。SANT-1在Shh-LIGHT2和BODIPY-Cyclopamine实验中，具有不同的抑制活性，且异常有效抑制SAG调节的通路激活。

SANT-1有效抑制Cyclopamine和Jervine诱导的Smo易位到初级纤毛上。SANT-1抑制PKA刺激的Smo运输到近端纤毛。当与HDAC抑制剂SAHA联用时，SANT-1能够抑制细胞增殖，且抑制抗Gemcitabine的胰腺癌细胞系Panc-1和BxPC-3的菌落形成。Smoothened是一种人类蛋白质，由SMO基因编码。Smoothened是一类Frizzled（F类）G蛋白偶联受体，是hedgehog信号通路的一个组成部分，从苍蝇到人类是保守的。

它是天然致畸剂环巴胺的分子靶标。细胞定位在SMO的功能中起重要作用，SMO作为7次跨膜蛋白锚定于细胞膜。通过声波刺猬配体刺激修补的12次跨膜受体导致SMO转移至脊椎动物中的初级纤毛，其过程涉及从初级纤毛中修补，其通常定位于其未刺激状态。在睫状体定位所需的结构域中发生突变的脊椎动物SMO通常不能促进hedgehog通路的激活。相反，SMO可以组成性地定位于初级纤毛，并且可能由于前述结构域中的色氨酸至亮氨酸突变而组成性地激活途径信号传导。

SMO已经示出通过沿膜的横向运送路径从所述主纤毛的纤毛膜本身附近质膜修补的刺激过程中移动，如通过囊泡通过定向转运反对。已知cAMP-PKA途径通常促进SMO的横向移动和刺猬蛋白信号转导。在像果蝇这样的无脊椎动物中，SMO不会在纤毛上组织，而是在刺猬结合到修补后通常易位到质膜。细胞定位后，SMO必须另外通过不同的机制激活，以刺激hedgehog信号转导，但该机制尚不清楚。

有证据表明存在一种未鉴定的内源性配体，它可以结合SMO并激活它。据信SMO中的突变可以模拟配体诱导的SMO构象并激活组成型信号转导。SMO可以作为致癌基因发挥作用。激活SMO突变可导致hedgehog途径的不受调节的激活，并且可用作癌症的驱动突变，例如成神经管细胞瘤，基底细胞癌，胰腺癌和前列腺癌。

因此，SMO是一种有吸引力的抗癌药物靶标，以及已知直接靶向SMO的许多hedgehog通路激动剂和拮抗剂。已知胆固醇在调节总体hedgehog途径中是至关重要的，并且胆固醇合成途径中的先天性突变可以特异性地使SMO失活，导致发育障碍。例如，氧甾醇20（S）-OHC已知通过结合附近的其细胞外氨基末端区中的富含半胱氨酸结构域激活脊椎动物SMO。在癌症的情况下，20（S）-OHC是所提出的抗癌氧固醇结合抑制剂的靶标。

应用^[7][8]

SANT-1(Hedgehog/Smoothened拮抗剂)可用于诱导细胞死亡：

利用SANT-1诱导细胞死亡构建了SANT1突变体SANT1-S1和SANT1-S2,它们基本序列完全一致,具有相同蛋白翻译潜能,但只有SANT1-S1与SANT1高级结构类似。在肾癌细胞系中转染表达质粒之后,只有SANT1和SANT1-S1保持了诱导基因表达的功能,说明SANT1的功能基础是其作为蛋白结合骨架的高级结构。通过软件预测,我们发现SANT1和SANT1-S1同SFPQ蛋白具有高结合能力,而SANT1-S2的结合力则被显著削弱。

通过CLIP实验,证明了SANT1与SFPQ的直接结合,同时在SANT1高表达的癌旁组织和769-P细胞中,启动子区SFPQ的结合显著降低,说明SFPQ在SLC47A2启动子区参与形成转录抑制型蛋白复合物。据文献报道,SFPQ可以与HDAC1形成蛋白复合物,通过抑制启动子区H3K27ac的修饰水平而抑制基因表达。

由于HDAC1与E2F1形成的复合物同c-Myc/E2F1/miR-20a环路对SLC47A2的表达调节密切相关,因此推测SFPQ与E2F1/HDAC1可以形成复合物,共同参与基因表达调节。Co-IP实验验证了769-P细胞系中SFPQ/E2F1/HDAC1的存在,结构完整的SANT1可以与靶向于SLC47A2的SFPQ/E2F1/HDAC1复合物形成RNA-蛋白复合体,介导E2F1/HDAC1的脱靶。SANT1高表达引起的E2F1/HDAC1的脱靶引起启动子区H3K27ac修饰水平和S-5-PRNAPII结合的显著上调,激活了基因的转录水平。

参考文献

[1]Renal cancer[J] . Umberto Capitanio,Francesco Montorsi.  The Lancet . 2016 (1002)

[2]MicroRNA-20b-5p functions as a tumor suppressor in renal cell carcinomaby regulating cellular proliferation, migration and apoptosis[J] . Yifan Li,Duqun Chen,Lu Jin,Jiaju Liu,Zhengming Su,Yuchi Li,Yaoting Gui,Yongqing Lai.  Molecular Medicine Reports . 2016 (2)

[3]LncRNA-HOTAIR promotes TNF-α production in cardiomyocytes of LPS-induced sepsis mice by activating NF-κB pathway[J] . Hongwei Wu,Jinfeng Liu,Wei li,Gang Liu,Zhenguang Li.  Biochemical and Biophysical Research Communicatio . 2016

[4]C-It-Loci: a knowledge database for tissue-enriched loci[J] . Weirick Tyler,John David,Dimmeler Stefanie,Uchida Shizuka.  Bioinformatics . 2015 (21)

[5]Propofol promotes cell apoptosis via inhibiting HOTAIR mediated mTOR pathway in cervical cancer[J] . Dan Zhang,Xin-hui Zhou,Jian Zhang,Yun-xiao Zhou,Jun Ying,Guo-qing Wu,Jian-hua Qian.  Biochemical and Biophysical Research Communicatio . 2015

[6]LncRNA HOTAIR: A master regulator of chromatin dynamics and cancer[J] . Arunoday Bhan,Subhrangsu S. Mandal.  BBA - Reviews on Cancer . 2015 (1)

[7]A Micropeptide Encoded by a Putative Long Noncoding RNA Regulates Muscle Performance[J] . Douglas M. Anderson,Kelly M. Anderson,Chi-Lun Chang,Catherine A. Makarewich,Benjamin R. Nelson,John R. McAnally,Prasad Kasaragod,John M. Shelton,Jen Liou,Rhonda Bassel-Duby,Eric N. Olson.  Cell . 2015 (4)

[8]高章照. 非编码RNA SANT1和c-Myc/E2F1/miR-20a环路共同参与肾癌SLC47A2基因表观调节[D].浙江大学,2018.