大鼠胰淀素(Amylin)Elisa试剂盒的应用

背景^[1-3]

大鼠胰淀素(Amylin)Elisa试剂盒是一种专门用于定量检测大鼠血清、血浆及相关液体样本中Amylin含量的试剂盒。其工作原理基于双位点夹心酶联免疫吸附法（ELISA）。在检测过程中，标准品、待测样本和HRP标记的大鼠胰淀素抗体被加入预先包被大鼠胰淀素抗体的酶标孔中。经过温育和洗涤后，未结合的组分被去除，随后加入底物A、B，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅与样品中大鼠胰淀素的浓度呈正相关。

大鼠胰淀素(Amylin)Elisa试剂盒

大鼠胰淀素(Amylin)Elisa试剂盒操作步骤

实验开始前，各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在37℃溶解）；试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100μl（在使用前一小时内配制），酶标板加上覆膜,37℃反应60分钟。

3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约400μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

4.每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液）100μl，酶标板加上覆膜37℃反应60分钟。

5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

6.依序每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后立即进行检测。

应用^[4][5]

大鼠胰淀素(Amylin)Elisa试剂盒可以用于降糖药与胰淀素的相互关系研究

在2型糖尿病动物模型Goto-Kakizaki(GK)大鼠上,观察重组人胰高血糖素样肽-1(recombined human glucagon-like peptide 1,GLP-1)的降糖作用及对胰淀素分泌、表达的影响,探讨胰淀素与GLP-1降糖效应间的关系,并进一步从分子水平上阐明其作用机制。

方法:以同周龄、同性别的Wistar大鼠为正常对照组,自发性糖尿病GK大鼠连续皮下注射给药GLP-1 56、133μg/kg 12周,定期测定血糖,在第11周,测定进食后30、60min的餐后血糖。在给药的第12周测定腹腔注射糖耐量,同时从眼静脉丛取血。用大鼠胰淀素(Amylin)Elisa试剂盒ELASA法测定血样中胰淀素浓度。处死大鼠取出胰腺,在光镜下观察GK大鼠胰岛基本形态结构的变化计数胰岛的数目。用免疫组化技术评价胰岛组织中胰淀素含量。用荧光定量PCR法测定胰淀素及胰岛素mRNA表达。

大鼠胰淀素(Amylin)Elisa试剂盒结果:GLP-1对GK鼠血糖及糖耐量的影响以同周龄、同性别的Wistar大鼠为正常组,模型对照组的GK模型大鼠空腹及餐后血糖均明显高于正常对照组(P＜0.01)。GLP-1 56、133μg/kg能显著降低GK鼠餐后30、60min的血糖(P＜0.05),改善糖耐量。但是对于空腹血糖,GLP-1 56、133μg/kg均没有明显的影响(P＞0.05)。GLP-1对血清中胰淀素水平的影响与正常组相比,模型对照组大鼠的胰淀素水平在空腹及糖负荷后均明显降低(P＜0.05,P＜0.01)。GLP-1治疗组大鼠的空腹胰淀素水平有下降的趋势,但与模型对照组相比无统计学意义。糖负荷后,GLP-1显著升高了GK大鼠的胰淀素水平(P＜0.05)。表明GLP-1改善了胰岛的分泌功能。GLP-1对胰岛细胞中胰淀素含量的影响正常组大鼠的胰岛内,可见强阳性、深棕色的胰淀素染色斑块,在胰岛细胞中广泛分布,几乎充满了整个胰岛。在模型对照组的GK大鼠中,只见少量的弱阳性染色散在的分布在胰岛中。而GLP-1治疗的GK大鼠则呈现出较多的胰淀素阳性染色细胞,染色强度也有所增加。

大鼠胰淀素(Amylin)Elisa试剂盒提示,GLP-1增加了胰岛细胞中胰淀素的含量,与血清中水平的升高一致。GLP-1对胰岛组织形态和胰岛数目的影响模型对照组GK鼠的胰岛已不能保持规整圆形,表现为胰岛萎缩,边缘皱缩,并可观察到胰腺滤泡与胰岛交错生长。甚至失去胰岛结构,完全萎缩、崩解,与周围组织混合。GLP-1 56、133μg/kg治疗对胰岛结构均有所改善,胰岛的界限趋于清楚,外形趋于完整,核结构清晰,细胞排列整齐。表明GLP-1促进GK大鼠的胰岛结构逐步恢复和改善,但对胰岛数目无明显的影响(P＞0.05)。

大鼠胰淀素(Amylin)Elisa试剂盒提示,GLP-1增加了胰淀素的分泌和表达,但这并没有影响其降糖的效应及对胰岛结构的改善。GLP-1对胰淀素及胰岛素mRNA表达水平的影响GK模型鼠胰岛中胰淀素及胰岛素的mRNA表达水平均显著降低(P＜0.01),但胰淀素mRNA/胰岛素mRNA的比值远远大于正常组(P＜0.05)。GLP-1上调了胰淀素和胰岛素的mRNA表达水平,降低了胰淀素mRNA/胰岛素mRNA的比值。相关性分析显示,胰淀素mRNA水平及胰岛素的mRNA水平与血糖均呈现负相关,而胰淀素mRNA/胰岛素mRNA的比值与血糖呈现正相关。提示GLP-1对胰淀素mRNA/胰岛素mRNA比值的降低可能是其降糖的机制之一。

参考文献

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[5]翁鸿博.降糖药与胰淀素的相互关系研究[D].复旦大学,2009.