小鼠子宫内膜上皮细胞的分离和原代培养

背景及概述^[1-2]

上皮细胞覆盖于身体表面并衬贴于体内空腔器官腔面的细胞。其排列有明显极性，一面朝向身体表面或腔面，称游离面；一面向着深部的结缔组织，称基底面。上皮细胞具有强大的角生和更新能力。上皮组织具有保护、吸收、分泌和排泄等作用。当上皮细胞受损时，则影响机体的防御功能。子宫组织由上皮细胞、基质细胞以及平滑肌细胞组成，是雌性哺乳动物孕育胎儿的器官，在生殖活动中占有重要地位，体外培养的子宫细胞可以作为胚胎和胚胎干细胞系的饲养层。随着组织工程学的发展，体外构建组织工程化子宫片层已成为现实，为进一步研究子宫疾病和胚胎着床提供了更理想的实验模型。而以上研究均需要大量的、高纯度的子宫细胞，国内外学者对子宫细胞的分离、培养方法进行了大量研究。1989年根据细胞沉降速度不同分离得到子宫细胞；采用74μm(200目)和35μm(350目)的滤网过滤2次，获得纯度较高的人子宫细胞；将悬浮的子宫内膜细胞吸附在用抗体包被的免疫磁珠上，也成功分离了子宫细胞，但以上方法均有不足。小鼠子宫内膜上皮细胞采用先胶原酶消化、后组织贴块法，结合上皮细胞专用培养基培养筛选制备而来，细胞总量约为5×10^5cells/瓶；细胞经Cytokeratin-19/PCK免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

分离和原代培养　^[2]

(1)颈部脱臼法处死妊娠第4天(d4)的孕鼠，在无菌条件下摘取小鼠的子宫；(2)在超净工作台上将子宫组织在无钙、镁的0.01MPBS中洗去血块和黏液，在低倍解剖镜下用眼科剪去除组织周围的脂肪块和血管；(3)在解剖镜下沿子宫腔将其纵向切开，内膜面朝上展平于培养皿中。加入1g/LⅠ型胶原酶消化液，37℃消化30min，其间可振荡数次；(4)消化结束后轻轻吹打组织块，挑出大块组织，按10%的浓度加入胎牛血清(fetalbovineserum，FBS)或培养液终止消化，将消化后的细胞悬液经150μm筛网过滤，除去黏液和未消化的组织，将消化液转移至含10mLPBS的离心管中静置10min；(5)弃去上层液，下层液500×g离心10min；离心结束后弃去上清液，而后血清培养液重新悬浮细胞，500×g离心10min。重复此操作清洗细胞2次；(6)检查细胞悬液中细胞密度，并将其密度调整到5×105个细胞/mL；(7)以0.5mL/孔将细胞接种于24孔培养板中，置入37℃、5%CO2的培养箱中培养。

培养4～5h后细胞可以贴壁生长，24h细胞即可生成单层，单层细胞排列紧密，呈长、圆或多角形生长(图1)。

免疫组化纯度鉴定　^[2]

(1)将子宫上皮细胞接种于多聚赖氨酸包被的盖玻片上，放入CO2培养箱中培养；(2)待细胞单层形成以后取出盖玻片，用预冷的PBS漂洗2次；(3)在含有4%多聚甲醛的PBS液中室温下固定30min；(4)用含3%H2O2的PBS在室温下封闭30min；(5)取出盖玻片在PBS中洗3次，每次5min，擦去边缘多余水分；(6)添加10%的正常羊血清，室温下在湿盒内放置40min；(7)轻轻甩掉血清，添加一抗工作液，置于湿盒内4℃孵育过夜；(8)次日将盖玻片在PBS中漂洗3次，每次5min，擦干边缘水分；(9)加稀释好的生物素标记的羊抗兔IgG(GAR-B，1∶150)，放于湿盒内室温孵育2h；(10)将盖玻片在PBS中漂洗3次，每次5min，擦干边缘水分；(11)加稀释好的辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)标记的链酶亲和素(SP-HRP，1∶200)，放于湿盒室温孵育2h；(12)将盖玻片在PBS中漂洗3次，每次5min，擦干边缘水分；(13)加入3，3′-二氨基联苯胺(3，3′-diaminobenzidin，DAB)显色液，显微镜下控制显色的强度；(14)苏木精染液进行复染，10s后，于自来水中漂洗5min；(15)用30%、50%70%、95%、100%的梯度酒精脱水(组织块脱水时间：30%、50%、70%各2min，100%5min)，二甲苯透明后中性树胶封片。

角蛋白阳性反应主要存在于细胞质，染色为棕色，主要分布在胞质区域，细胞核在苏木精复染后呈蓝色(图2)。细胞纯度大于95%。

相关研究^[3]

有研究在体外培养条件下研究卵巢激素诱导小鼠子宫内膜上皮细胞cyclinG1的表达及细胞增殖和细胞周期进程的变化，以探讨孕激素依赖的细胞周期调控因子cyclinG1对子宫内膜上皮细胞增殖的负调控作用。原代培养小鼠子宫内膜上皮细胞，待其生长汇合后分为4组：对照组(C组)、雌激素组(E组)、孕激素组(P组)、雌、孕激素共同作用组(EP组)。加入相应激素作用24h后，用细胞免疫化学方法检测各组细胞cyclinG1的表达水平；四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测各组细胞活力，间接观察子宫内膜上皮细胞的增殖情况；用流式细胞仪检测分布在细胞周期各时相的子宫内膜上皮细胞所占百分数。细胞免疫化学结果显示，cyclinG1在C组和E组子宫内膜上皮细胞上无明显表达，而在P组和EP组子宫内膜上皮细胞中表达明显，且定位于细胞核内。MTT法结果显示，与C组相比，E组细胞活力明显增高，而P组和EP组的细胞活力均明显下降，表明雌激素能促进子宫内膜上皮细胞增殖，而孕激素则具有抑制子宫内膜上皮细胞增殖的作用。流式细胞术检测显示，与C组相比，E组中处于S期的子宫内膜上皮细胞百分数增多；P组与EP组中处于S期的子宫内膜上皮细胞百分数明显减少，而处于G1期的细胞百分数和G2/M期的细胞百分数则明显增加。上述结果提示，孕激素依赖的cyclinG1可能通过阻滞细胞周期进程来参与孕激素对子宫内膜上皮细胞增殖的负调控作用。

主要参考资料

[1] 儿科学辞典

[2] 小鼠子宫内膜上皮细胞的分离和原代培养＊

[3] 孕激素诱导cyclinG1在小鼠子宫内膜上皮细胞的表达及其对细胞增殖的影响