人气管上皮细胞的培养

背景及概述^[1-2]

上皮细胞覆盖于身体表面并衬贴于体内空腔器官腔面的细胞。其排列有明显极性，一面朝向身体表面或腔面，称游离面；一面向着深部的结缔组织，称基底面。上皮细胞具有强大的角生和更新能力。上皮组织具有保护、吸收、分泌和排泄等作用。当上皮细胞受损时，则影响机体的防御功能。人气管上皮细胞分离自气管组织；气管上皮是气道与外界环境接触的道防线，不仅是各种病原体、炎症介质作用的靶细胞，还作为效应细胞合成、释放多种炎性介质和细胞因子从而参与气道炎症及免疫反应。体外培养的原代人气管上皮细胞因与体内组织在形态结构和功能活动上存在很大的相似性，因此，在基础及临床研究中极为重要。

分离、培养^[2]

获取的气管组织需保存于低温PBS溶液中，消化分离前使用无菌PBS冲洗，去除多余的连接组织和淋巴结等，尽量只留气管内部表面组织。用手术刀将组织切成1cm×2cm的碎片，置于PBS（含1mg／ml蛋白酶XⅣ）中，4℃消化12～24h，10％FBS终止消化后，振摇分离上皮细胞，600×g离心5min。加入配制好的BEGM（含100IU／ml青霉素，100IU／ml链霉素）培养液重悬细胞，转移入培养皿中，37℃孵育1h。采用差速贴壁法除去先贴壁的成纤维细胞后，再收集上皮细胞，调整密度后接种于Ⅰ／Ⅲ胶原包被的培养皿中，于37℃，5%CO2条件下培养。细胞贴壁后，每隔1d更换1次培养基，同时观察记录细胞的生长状态。

ALI培养^[2]

将培养的上皮细胞用0.05%胰酶消化后，使用BEGM重悬细胞，接种于预铺人Ⅳ型胎盘胶原的0.4μmTranswell支持膜上，每孔细胞数量约为5×105个，同时在膜下层也加入培养液BEGM，置37℃，5％CO2培养箱中培养，隔天更换1次培养基。待单层细胞达80％～90％融合时，移去支持膜上层培养基，只在膜下层加ALI培养基（DMEM︰BEGM为1︰1，5×10-8MRA，100IU／ml青霉素，100IU／ml链霉素），进行ALI培养，每隔1d更换1次培养基，置37℃，5％CO2培养箱培养4～6周，同时观察记录细胞的生长分化状况。

显微镜观察

上皮细胞贴壁后，光镜下观察原代及ALI培养细胞的生长状况，电镜观察原

代细胞的纤毛结构。光镜下观察显示，气管上皮经低温过夜消化后，大部分组织被消化成单个细胞（图1A），视野下有极少数的纤毛细胞；接种于预铺Ⅰ／Ⅲ型胶原培养皿中3d后，细胞贴壁良好，视野下呈簇状分布（图1B）；培养7d后，细胞数量可达90%以上（图1C）。倒置相差显微镜观察显示，分离的细胞生长状态良好，增殖速度较快，细胞呈“铺路石”样分布。通过培养的成纤维细胞对照（图1D），可见分离的细胞形态符合上皮细胞的特征，成纤维细胞较少。

主要参考资料

[1] 儿科学辞典

[2] 人气管上皮细胞的原代分离及气液界面培养