A-431人表皮癌细胞的应用

背景^[1-3]

A-431人表皮癌细胞是一种人表皮样癌细胞系，源自一名85岁患有表皮样癌的女性的表皮。这种细胞系由D.J.Giard等人建立，并广泛应用于生物医学研究领域，特别是在癌症生物学、免疫肿瘤学和毒理学研究方面。

A-431细胞具有上皮形态，并表现出贴壁生长的特性。这些细胞在培养中形成了细胞团簇。它们是超三倍体人细胞株，模态染色体数为74，约在36%的细胞中存在。此外，A-431细胞过度表达表皮生长因子受体（EGFR），因此，它们也被用作研究细胞周期和癌症相关的细胞信号通路的有价值的体外模型。

在实验中，A-431细胞在抗胸腺细胞球蛋白、血清处理的NIH瑞士小鼠中可以形成类似于恶性黑素瘤快速增长的皮下肿瘤，而在普通成纤维细胞饲养层和琼脂上则可以形成克隆。这些特性使得A-431细胞成为3D细胞培养、高通量筛选以及癌症研究的理想选择。

A-431人表皮癌细胞

A-431人表皮癌细胞培养操作

1)复苏A-431人表皮癌细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)A-431人表皮癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)A-431人表皮癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

A-431人表皮癌细胞可以用于姜黄素对皮肤鳞状细胞癌A-431人表皮癌细胞增殖和凋亡的影响

姜黄素具有抗氧化、抗肿瘤、抗凝、抗炎、抗动脉粥样硬化、降血脂等重要作用,它是一种从自然界广泛存在的姜黄的根茎中提取的天然活性酚类色素。目前研究显示,姜黄素能抑制肿瘤细胞的生长、增殖并诱导其凋亡,其抗肿瘤机制已成为研究的热点,但其是否具有抑制皮肤癌细胞生长的作用尚不明确,这方面的研究还较少。

研究姜黄素对A-431人表皮癌细胞生长、增殖和凋亡的影响,探讨姜黄素抗人表皮鳞状细胞癌的分子机制,为临床皮肤癌的治疗提供新的实验理论依据。

方法1.采用MTT法检测不同时间不同浓度姜黄素加药对A-431人表皮癌细胞生长增殖的影响：空白对照、低、中、高四个浓度(O、20、40、80 umol/l)的姜黄素分别加药A-431人表皮癌细胞三个时间点后(24 h、48 h、72 h),MTT比色法检测姜黄素对A-431人表皮癌细胞增殖活力的影响。

2. 检测姜黄素诱导A-431人表皮癌细胞凋亡的作用：倒置显微镜观察空白对照组和加药姜黄素组A-431人表皮癌细胞的形态学特征、生长变化情况；单细胞凝胶电泳法分析不同浓度不同时间姜黄素处理A-431人表皮癌细胞DNA的受损情况；流式细胞术检测姜黄素处理对A-431人表皮癌细胞凋亡率的影响。

3. 探讨姜黄索诱导A-431人表皮癌细胞凋亡的分子机制：Western blot法检测姜黄素对A-431人表皮癌细胞Caspase-3蛋白表达的影响。

结果1.姜黄素可以明显的抑制A-431人表皮癌细胞生长增殖,呈剂量依赖性,随着姜黄素药物浓度的增高和作用时间的增长,抑制作用越来越强。实验组与对照组比较,吸光度值和抑制率均有统计学差异P<0.05)。

2. 姜黄素处理后,光镜下部分细胞呈现典型凋亡形态学改变；单细胞凝胶电泳结果显示随着姜黄素加药浓度的增高和作用时间的增长,A-431人表皮癌细胞DNA损伤增加；流式细胞仪器检测结果显示,随着姜黄素加药浓度的增高和作用时间的增长,人表皮鳞状细胞癌A431的细胞凋亡率也上升。

3. Western blot结果显示,随着姜黄素加药浓度的升高和时间的增长,与对照相比,A-431人表皮癌细胞的Caspase-3蛋白表达水平也有不同程度的升高。

结论姜黄素具有抑制A-431人表皮癌细胞的增殖,并诱导其凋亡的作用,姜黄素加药后,A-431人表皮癌细胞DNA的损伤及Caspase-3蛋白表达的上调可能参与其凋亡过程。

参考文献

[1]Cytotoxicity of curcumin silica nanoparticle complexes conjugated with hyaluronic acid on colon cancer cells[J].Surya Prakash Singh;;Mrinalini Sharma;;Pradeep Kumar Gupta.International Journal of Biological Macromolecules,2015

[2]Large solitary fibrous tumor of the oral cavity—Report of a case[J].Denise Hélen Imaculada Pereira de Oliveira;;Assis Filipe Medeiros Albuquerque;;Matheus Dantas de Araújo Barreto;;Cassiano Francisco Weege Nonaka;;JoséSandro Pereira da Silva;;Adriano Rocha Germano;;Lélia Maria Guedes Queiroz.Pathology-Research and Practice,2014

[3]Curcumin suppresses tumor necrosis factor?α?induced matrix metalloproteinase?2expression and activity in rat vascular smooth muscle cells via the NF?κB pathway[J].Yi Zhong;;Wenyan Yu;;Jian Feng;;Zhongcai Fan;;Jiafu Li.Experimental and Therapeutic Medicine,2014(6)

[4]Antitumor and Antiangiogenic Activities of Curcumin in Cervical Cancer Xenografts in Nude Mice[J].Pornphrom Yoysungnoen-Chintana;;Parvapan Bhattarakosol;;Suthiluk Patumraj;;Kota V.Ramana.BioMed Research International,2014

[5]翟立广.姜黄素对皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖和凋亡的影响[D].新乡医学院,2016.