引物合成服务

背景^[1-7]

引物合成服务基本采用固相亚磷酰胺三酯法。亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。引物合成服务包括：普通引物合成；修饰/标记引物合成；双/多重荧光标记引物合成；引物纯化，有RPC纯化、PAGE纯化、HPLC纯化等方法；各种检测质控方法，有HPLC、MC、CGE等方法。

合成方法：

1.是将预先连接在固相载体上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5′-羟基的保护基团DMT，获得游离的5′-羟基。

2.合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3′端被活化，5′-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应。

3.带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5′-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在后续环节根据实验需要来选择纯化方式分离掉。

4.在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。

经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5′-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC,PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩,脱盐，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。

引物纯化方法：

1.C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶剂溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。这种方法一般不会对普通PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。

2.OPC纯化：OPC纯化是根据DNA保护基（DMTr基）和Cartridge柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段。

3.PAGE纯：PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的DNA纯度大于95%，对长链Oligo DNA(大于50mer)的纯化特别有效。

4.HPLC纯化：HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理，对DNA片段进行纯化。纯度可以大于99%。主要用于短链和修饰引物的纯化。

应用^[8]

引物合成服务可用于PCR、qPCR、rtPCR实验：

在荧光定量RT-PCR检测高致病性PRRSV方法的建立实验中在PRRSV的全基因组序列中,Nsp2基因是序列变异的基因之一。2006年5月以来,我国部分猪场暴发了一种以高热、高发病率和高死亡率为特征的传染性疾病。经病原分离及分子流行病学分析证明是由一种带有Nsp2基因部分缺失的、对猪呈高致病性的猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的。

1将扩增SC-JX01株得到的Nsp2基因cDNA片段克隆于pMD-T载体中。提取pMD-Nsp2质粒,测序后利用DNASTAR软件分析,参考国内外已经发表的Nsp2基因序列进行比较。经核酸序列分析比对后发现,SC-JX01株Nsp2基因与Genbank已发表的高致病性PRRSV Nsp2基因序列的相似性较高为98.1%-99.1%,氨基酸的相似性为96.3%-98.3%,表明所获得Nsp2基因序列的毒株属高致病性PRRSV型。

同时发现共有30个氨基酸缺失,缺少氨基酸分别位于第481、第532-560位。将分离株与分离自不同地区高热病毒株的基因序列相比较,发现全部都具有相同的缺失,这说明引起猪高热病的病原变异不大;与较早期分离的AY150312、AY262352等毒株进行比较,发现缺失部位不同。对SC-JX01株Nsp2基因氨基酸的亲水性和蛋白表面可能性进行分析,表明与SC-JX01株Nsp2基因氨基酸序列性质一致。

参考文献

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[2]Chimeric Arteriviruses Generated by Swapping of the M Protein Ectodomain Rule Out a Role of This Domain in Viral Targeting[J].M.H.Verheije,T.J.M.Welting,H.T.Jansen,P.J.M.Rottier,J.J.M.Meulenberg.Virology.2002(2)

[3]Heterogeneity of porcine reproductive and respiratory syndrome virus:implications for current vaccine efficacy and future vaccine development[J].X.J Meng.Veterinary Microbiology.2000(4)

[4]Mutations in the genome of porcine reproductive and respiratory syndrome virus responsible for the attenuation phenotype[J].R.Allende,G.F.Kutish,W.Laegreid,Z.Lu,T.L.Lewis,D.L.Rock,J.Friesen,J.A.Galeota,A.R.Doster,F.A.Osorio.Archives of Virology.2000(6)

[5]Determination of the complete nucleotide sequence of a vaccine strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and identification of the Nsp2 gene with a unique insertion[J].S.Shen,J.Kwang,W.Liu,D.X.Liu.Archives of Virology.2000(5)

[6]A nonstructural and antigenic glycoprotein is encoded by ORF3 of the IAF-Klop strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].P.Gonin,H.Mardassi,C.A.Gagnon,B.Massie,S.Dea.Archives of Virology.1998(10)

[7]Comparative study of a blocking enzyme-linked immunosorbent assay and the immunoperoxidase monolayer assay for the detection of antibodies to the porcine reproductive and respiratory syndrome virus in pigs[J].S.Houben,P.Callebaut,M.B.Pensaert.Journal of Virological Methods.1995(1)

[8]郭杨.荧光定量RT-PCR检测高致病性PRRSV方法的建立[D].四川农业大学,2009.