小鼠骨骼肌卫星细胞的相关研究

背景及概述^[1-2]

卫星细胞是一种神经胶质细胞。分布于周围神经系统的神经胶质有两种，一称Schwann细胞，亦名神经膜细胞，另一种即为卫星细胞。后者位于神经细胞胞体的周围，为扁平或立方形，可能有保护和营养神经元的作用。小鼠骨骼肌卫星细胞（skeletalmusclesatellitecell）是位于肌细胞膜和基膜之间的具有增殖和分化潜力的生肌干细胞，这些细胞对于出生后骨骼肌的生长和再生具有重要的意义。骨骼肌卫星细胞（通常以静息状态存在于肌纤维肌膜与基底膜之间，在一定条件下可以被激活，发生增殖和分化，形成骨骼肌细胞。1961年首次在蛙的肌肉中发现了肌卫星细胞，其后，有多种动物的肌卫星细胞被成功分离，并进行了体外培养。肌卫星细胞在肌肉的发育和再生中发挥了重要作用，而肌卫星细胞的增殖和分化受众多因素的影响，目前，其分离效率仍然很低，建立高效的体外培养、鉴定与诱导分化方法仍然是卫星细胞研究和利用的关键。

小鼠肌卫星细胞分离培养^[2]

1）小鼠肌卫星细胞分离培养

将小鼠颈椎脱臼处死后，浸泡于75%酒精中消毒5min，然后在无菌条件下剥开后肢皮肤。将后肢切下后于平皿内小心去掉脂肪和骨骼，留肌肉组织。将肌肉组织用PBS冲洗后，于无菌平皿中用眼科剪反复剪碎至1mm3大小。组织块置PBS中静置，弃上清液。将PBS清洗后的组织块置于适量0.2%胶原酶Ⅱ中，于37℃消化1h，每10min振荡一次。1000r/min离心10min后弃上清液，再加入0.25%胰酶，于37℃消化30min，每10min振荡一次。之后，加入含血清的生长培养基（含20%胎牛血清的DMEM培养基）终止消化，细胞悬液分别过100、200和400目细胞筛，过滤后的细胞悬液于1000r/min离心10min，弃上清液，细胞沉淀用生长培养基重悬后接种于60mm直径培养皿内，于37℃、5%CO2培养箱中培养。

2）肌卫星细胞纯化及传代培养

采用差速贴壁方法进行纯化，分离出的细胞在培养箱中培养2 h，此时贴壁细胞主要为成纤维细胞。然后，将未贴壁细胞转入新的培养皿中培养，第4天换液去除血细胞及未贴壁的死细胞，并观察细胞生长情况。细胞生长至70%汇合时传代，弃去培养皿中培养基，PBS洗涤1～2次后加入适量0.25%胰酶消化液，显微镜下观察，细胞胞质回缩、开始变圆时用手轻拍培养皿。当绝大部分细胞脱落后，立即加入含血清培养基终止消化，细胞悬液用枪头反复吹吸后，于1 000 r/min离心10 min，弃上清液，细胞沉淀重悬后按1∶2或1∶3接种于新培养皿内，3～5 d传代一次，每次传代均差速贴壁30 min，以去除成纤维细胞。

3）肌卫星细胞诱导分化

肌卫星细胞传代培养贴壁后，将培养基更换为分化培养基（含2%马血清的DMEM）进行成肌诱导分化培养，观察肌卫星细胞分化情况及肌管形成状态。

 4）结果

原代肌卫星细胞分离培养前两天仅有少量细胞贴壁（图1a、1b），第3天有更多细胞开始贴壁（图1c、1d），第4天可以换液，此时细胞中成纤维细胞较多。经过两次差速贴壁纯化，细胞纯度增加，第3代肌卫星细胞相对纯度较高，细胞生长状态良好，生长方式和形态特点一致（图1g、1h）。肌卫星细胞开始贴壁生长时呈梭形，折光性强，散在分布。

培养一段时间后，细胞密度增大，并开始出现方向性，密度继续增大后应及时传代。分化培养基培养可诱导肌卫星细胞进入分化状态，加分化培养基后第2天，开始出现零星肌管（图2a、2b），在分化培养基添加后的第5天形成大量肌管，并排列成束，肌管状态良好，大部分肌管可观察到自发性跳动现象（图2c、2d）。

原代培养^[3]

取小鼠后肢肌肉组织，取出脂肪，采用胰酶消化法获得细胞悬液，经差速贴壁法纯化骨骼肌卫星细胞，通过免疫细胞化学方法鉴定骨骼肌卫星细胞，用此法分离到了小鼠骨骼肌卫星细胞。取第3代生长旺盛的骨骼肌卫星细胞用慢病毒进行转染。结果分离到的细胞呈小圆形，培养2天后可见纺锤形细胞。培养3天后卫星细胞开始增殖。用携带绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的慢病毒转染细胞，第4天可见绿色荧光蛋白表达。本研究分离培养出了小鼠骨骼肌卫星细胞，并用携带绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的慢病毒成功转染小鼠骨骼肌卫星细胞，该试验为进一步开展哺乳动物骨骼肌生长和发育机理的研究奠定了前期基础。

相关研究^[4-5]

有研究探讨CM-DiI标记小鼠骨骼肌卫星细胞后移植治疗心肌梗死的体外体内示踪作用。方法CM-DiI标记提纯后小鼠骨骼肌卫星细胞，检测标记率及荧光情况，观察CM-DiI对细胞增殖分化的影响。小鼠心梗模型心肌内注射标记后的卫星细胞，于移植后1、3、7、14、21、28天取出心脏行冰冻切片，观察移植细胞在体存活分化情况。结果CM-DiI标记骨骼肌卫星细胞效率达(93.3±0.95)%，3代后仍保持红色荧光，对细胞增殖及分化无明显影响。标记细胞移植1天后即可见细胞团聚，3天后细胞排列整齐，4周后仍可见移植细胞。结论CM-DiI细胞标记液标记骨骼肌卫星细胞，安全简单，并可示踪移植后细胞的存活分化情况。

此外，还有实验研究耐力、力量、混合运动3种训练方式激活静息状态卫星细胞的能力。方法：将32只3月龄C57BL/6小鼠随机分成4组：安静组(C，n=8)，耐力运动训练组(E，n=8)，力量运动训练组(S，n=8)，混合运动训练组(M，n=8)。经过28周运动干涉后，采用实时荧光定量PCR法检测胫骨前肌卫星细胞激活信号通路中相关基因(nNOS，MMP-2，HGF，c-met)mRNA的转录水平。结果：1)与安静组相比，3组运动训练组C57BL/6小鼠胫骨前肌与体重的比值增加；2)耐力训练组nNOS，HGF，c-metmRNA转录水平显著增加，MMP-2mRNA无显著性差异；3)力量训练组nNOS，MMP-2，HGF，c-metmRNA转录水平显著增加；4)混合训练组nNOS，MMP-2，c-metmRNA转录水平无显著性变化，HGFmRNA转录水平显著增加。结论：力量运动对骨骼肌中卫星细胞的激活具有明显的促进作用，在维持骨骼肌卫星细胞池的数量和促进骨骼肌肥大中具有显著意义；耐力运动能促进卫星细胞的激活，在防止骨骼肌中卫星细胞数量减少，在维持骨骼肌质量和力量上，也有其可取之处；混合训练组在促进卫星细胞激活的过程中，混合运动的效果并不是预期所设想的耐力和力量运动的效果叠加，提示在维持卫星细胞数量和促进骨骼肌肥大上应考虑运动强度、时间和频率，合理安排耐力和力量运动。

主要参考资料

[1] 协和医学词典

[2] 小鼠骨骼肌卫星细胞的分离培养和鉴定

[3] 小鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养及慢病毒转染

[4] CM-DiI标记在小鼠骨骼肌卫星细胞移植治疗心肌梗死中的示踪

[5] 研究耐力、力量和混合运动对成年C57BL/6小鼠骨骼肌卫星细胞激活信号通路的影响