人牙周膜成纤维细胞的特征

背景及概述^[1-2]

成纤维细胞是疏松结缔组织中最常见而且数量较多的一种细胞，位于胶原纤维近旁并依附于其上。此细胞的形态结构可随其功能状态的不同而改变。在功能活动旺盛时，成纤维细胞的胞体较大，呈扁平星形，有突起。胞核呈卵圆形，核染色质较少，着色浅，核仁明显。胞质较多，弱硷性，内含丰富的粗面内质网、核蛋白体、高尔基复合体以及微丝和微管等结构，表明此种细胞具有合成和分泌胶原蛋白、弹性蛋白和多糖蛋白，形成胶原纤维、弹性纤维、网状纤维和基质的作用。在相对静止或功能活动不活跃时的细胞，称为纤维细胞。这种细胞比成纤维细胞小，轮廓不甚清楚，多呈梭形。胞质少，弱嗜酸性，其中粗面内质网、高尔基复合体及其它细胞器均不发达。这表明纤维细胞是功能活动不活跃的细胞。但在一定条件下，如创伤修复，结缔组织再生时，纤维细胞可转化为功能活跃的成纤维细胞，积极参与合成和分泌蛋白质，形成纤维和基质。

牙周膜成纤维细胞是牙周膜组织中数量最多、功能上最重要的细胞。它能不断合成与降解胶原，维持牙周膜中胶原的更新与重建，以及通过分泌多种细胞活性因子刺激成骨细胞和破骨细胞完成牙周组织的修复与再生。人牙周膜成纤维细胞（PLFs）作为牙周膜的主体细胞，是牙周膜主要的间质细胞，它不仅具有合成胶原、基质、弹力纤维和糖蛋白的功能，还有吸收胶原吞噬异物的能力，还参与了牙周组织的病变、修复及再生过程。利用人牙周膜成纤维细胞建立体外细胞系已成为国内外学者研究正畸牙移动的重要手段。

形态特征^[1]

人牙周膜成纤维细胞分离自牙周膜组织。刚分离的人牙周膜成纤维细胞呈圆形、折光性良好，悬浮于培养基中。30min细胞贴壁，其中部分开始伸出伪足，表现为小的突起；6h后细胞基本贴壁完全，伸展成梭形，胞核清晰，分布较均匀，散在生长，不聚集成团；细胞生长迅速，5-7天即呈融合状态，细胞排列紧密，有的交叉重叠生长，平坦、胞体较大，细胞质透明，细胞核较大，呈椭圆形，颜色淡。细胞融合，并彼此连接成网状；细胞呈突起的纺锤形或星形的扁平分布。

细胞培养^[2]

牙周膜成纤维细胞的原代培养主要包括组织块法和酶消化法，20世纪90年代，组织块培养法操作简单，步骤较少，污染概率较小，纯度高，但组织贴壁率低、细胞游出率较低，原代培养时间长，也有学者运用玻片覆盖组织块法，即将剪切过的组织块接种于培养皿，后加盖玻片覆盖于组织块上，避免组织块漂浮，使得组织块与培养液尽量接触，利于细胞爬出；运用牙槽窝刮取组织块法，如此可以增加组织量，同时减少污染，但是容易混入牙龈及口腔黏膜，甚至是牙槽骨组织，纯度不可控制。酶消化培养法获取细胞量大，原代培养周期短，但操作步骤繁琐，污染概率高，酶消化时间不易把握，细胞损失多，且所获得的细胞纯度高。还有学者运用酶解法，即组织块法与酶消化法结合，组织块经胶原酶消化而蓬松，增加了与培养液的接触面积，更易吸收养分，利于细胞游出，但是组织块过小，不利于贴壁。

有实验采用组织块培养法，与上述方法相比，在操作过程中：①拔除牙齿立即放入含青链双抗的培养基中，置于冰盒中快速送达实验室，保持组织的新鲜度，但是摇松牙齿时可适当延长时间，使尽可能多的牙周膜附着于牙根一同拔除；②刮取牙周膜组织后用眼科剪剪碎，使组织块中的细胞尽量与培养液接触；③在种植组织块前用血清润瓶，利用血清的黏稠度吸附组织块增加贴壁率，同时也增加了原代培养的血清浓度，与以往报道实验结果一致；④培养液量控制在刚好浸没组织块，减少组织漂浮的可能性。本实验原代培养成功率也一样能达到80％。

相关研究^[3-4]

有研究为提高人牙周膜成纤维细胞(HPLF)原代培养的成功率，快速建立体外细胞研究模型。采取组织块与酶消化相结合的方法处理牙周膜组织块，获取细胞；用形态学、免疫细胞化学染色等方法鉴定细胞来源，通过生长曲线的测定研究体外细胞生长特性。结果原代培养成功率为778%。获得的细胞呈梭形，抗波形丝蛋白染色呈阳性，抗角蛋白染色呈阴性，符合人牙周膜成纤维细胞的形态学特征和生物学特性，生长良好。因此酶消化组织块法可显著提高人牙周膜成纤维细胞原代培养成功率，方法可行。

此外，有实验研究中药黄芩有效成分黄芩苷对脂多糖(LPS)抑制人牙周膜成纤维细胞(HPLFs)活性及对LPS损伤HPLFs超微结构的影响，并初步探讨其可能的作用机理。方法采用原代培养人牙周膜成纤维细胞技术、四唑盐(MTT)比色试验和透射电子显微镜技术(TEM)。结果LPS浓度为100μg/ml时明显抑制细胞活性，同时加入LPS和黄芩苷后，细胞活性明显增强(P0.05)。100μg/mlLPS对HPLFs各超微结构均有不同程度的损伤，特别是线粒体损伤严重，同时加入LPS和黄芩苷(10μg/ml)后，与LPS组比较，超微结构损伤减轻，细胞器结构表现也较正常。结论中药黄芩苷能显著促进成纤维细胞的增殖，对LPS抑制HPLFs活性和LPS损伤HPLFs超微结构具有保护作用，其作用机制可能与降解LPS及作用于细胞膜表面阻止LPS进入细胞内部有关。

主要参考资料

[1] 运动解剖学、运动医学大辞典

[2] 人牙周膜成纤维细胞培养与鉴定

[3] 酶消化组织块法原代培养人牙周膜成纤维细胞的初步研究

[4] 中药黄芩苷对人牙周膜成纤维细胞保护作用的实验研究