SP6核糖核酸聚合酶的应用

背景^[1-3]

SP6核糖核酸聚合酶也被称为SP6 RNA聚合酶，是一种由大肠杆菌中的噬菌体SP6产生的酶。这种酶具有在体外合成RNA分子的能力，因此，它常被用于体外转录实验，广泛应用于合成特定的RNA分子。

SP6核糖核酸聚合酶的主要特点是能够高度特异识别SP6启动子序列，是一种DNA依赖的5'→3'RNA聚合酶。它催化单链或双链DNA SP6启动子下游NTP的掺入，合成与SP6启动子下游的模板DNA互补的RNA。此外，SP6 RNA聚合酶还能识别修饰的NTP，例如生物素标记、荧光素标记的NTP，这使得它在各种标记RNA的合成中具有应用价值。

SP6核糖核酸聚合酶

在科研实验中，利用SP6核糖核酸聚合酶合成的RNA有多种应用，如制备杂交探针、进行基因组DNA序列分析、核糖核酸酶保护测定、反义RNA合成、作为体外翻译的RNA模板、RNA剪接研究的底物、RNA二级结构和RNA-蛋白质相互作用研究，以及核酸扩增分析等。此外，它还可以用于合成siRNA、miRNA等小RNA。

值得注意的是，使用SP6核糖核酸聚合酶时，必须以SP6 DNA或克隆在SP6启动子下游的DNA作为合成模板，并且该酶需要在特定的条件下储存，一般是-20°C。

应用^[4-5]

SP6核糖核酸聚合酶可以用于FasL基因的克隆化及其mRNA在肺癌组织中的表达分布

通过采用反转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术和分子克隆技术克隆人FasL基因片段，制备互补核糖核酸(cRNA)探针，采用原位杂交的方法观察FasL mRNA在肺癌组织细胞中的表达分布情况，并探讨其临床意义。

方法：分离健康人外周血单核细胞(PBMC)，终浓度为50mM，用植物血凝素-P(PHA-P)激活15分钟，诱导FasL基因表达，用人全血总RNA提取试剂盒(QIAamp RNA Blood Mini kit)提取总RNA，特异性引物反转录制备互补脱氧核糖核酸(cDNA)，聚合酶链反应扩增FasL基因片段，产物经琼脂糖凝胶电泳，显示在≈328bp处呈现1条与预期产物分子量大小相符的DNA扩增条带，按照QIAquick凝胶提取试剂盒说明进行胶上PCR产物回收，予以扩增、纯化，用PstI、EcoRI双酶切PCR产物和质粒pSPT19，使PCR产物和质粒DNA两端互补，用T4连接酶将其定向克隆入质粒中，转化感受态大肠杆菌JM109，在涂抹有氨苄青霉素的LB平板上进行蓝白筛选，获取有重组质粒的阳性转化子，插入的FasL cDNA经DAN测序证实与Genebank中FasL序列相同，用PstI酶酶切重组质粒，使之线性化，经SP6核糖核酸聚合酶体外转录制备地高辛标记的FasL cRNA探针(Dig-FasL cRNA)。收集青岛大学医学院附属医院胸外科手术切除的肺癌新鲜标本(经病理证实，其中鳞状细胞癌3例，腺癌2例，小细胞癌1例)，置于无菌Ep管中，经液氮速冻运输，转移至-70℃冰箱中备用，标本经4％多聚甲醛和15％蔗糖处理后制备成冰冻切片，厚度为6μm，再经多聚甲醛后固定，非离子型去污剂处理细胞膜，在切片上用cRNA探针进行原位杂交，经四唑氮蓝(NBT／BCIP)显色，镜下观察FasLmRNA在肺癌细胞中的表达分布情况。结果：DNA测序证实重组质粒中插入的FasL cDNA序列准确无误；地高辛标记的FasL cRNA探针经标记效率检测，标记效率满意；镜下观察发现三种病理类型的肺癌细胞胞浆中均可检测到蓝紫色杂交信号，表明肺癌细胞中存在FasL mRNA的表达。结论:FasL基因的克隆化成为肺癌细胞凋亡研究的工具;地高辛标记的FasL mRNA探针为进一步研究FasL mRNA在肺癌细胞中的表达分布提供了有效手段:FasL作为促细胞凋亡基因与肺癌的发生、发展有重要关系。

参考文献

[1]In situ T cells in melanoma[J].Per thor Straten;;Jürgen C.Becker;;Per Guldberg;;Jesper Zeuthen.Cancer Immunology,Immunotherapy,1999(7)

[2]Tumour escape from the immune response:the last hurdle for successful immunotherapy of cancer?[J].Graham Pawelec.Cancer Immunology,Immunotherapy,1999(7)

[3]Antitumor activity exhibited by Fas ligand(CD95L)overexpressed on lymphoid cells against Fas+tumor cells[J].Motomu Shimizu;;Yasutaka Takeda;;Hideo Yagita;;Takayuki Yoshimoto;;Akio Matsuzawa.Cancer Immunology,Immunotherapy,1998(3)

[4]T cell–tumor cell:a fatal interaction?[J].Dale B.Chappell;;Nicholas P.Restifo.Cancer Immunology,Immunotherapy,1998(2)

[5]彭传亮.FasL基因的克隆化及其mRNA在肺癌组织中的表达分布[D].青岛大学,2004.