低限量 EAGLE 培养基的应用

背景^[1-3]

低限量EAGLE培养基，也称为MEM细胞培养基，是在Eagle's基础培养基（BME）的基础上改良而来的。它于1959年进行修改，删去了赖氨酸和生物素，并增加了氨基酸的浓度，从而使其更适合多种细胞的单层生长。这种培养基具有高压灭菌的品种，是最基本且适用范围最广的培养基之一。

然而，由于营养成分的限制，低限量Eagle培养基在针对特定细胞的培养与表达时，可能并非效果最佳或最经济的选择。此外，这种培养基中缺乏L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸和L-谷氨酰胺，但补充了L-Ala-L-Gln二肽，为细胞培养提供了更稳定的谷氨酰胺形式，因为游离氨基酸L-谷氨酰胺在细胞培养中是不稳定的。

低限量Eagle培养基常用于在FBS、小牛或马血清存在下生长附着的细胞系，例如成纤维细胞。它已广泛应用于各种细胞培养实验，为科研工作者提供了重要的实验工具。

低限量EAGLE培养基

低限量Eagle培养基使用步骤：

1.配置前准备：首先，需要准备新制备的milli water用于配置培养基，并确保调节pH值的酸碱溶液也使用这种水配置。同时，用于制备培养基的器皿需要清洗干净，并用milli water润洗两次。

2.溶解培养基：取一定量的milli water（如5%终体积）加入到适当的容器中（如1L玻璃杯）。然后，将干粉培养基倒入烧杯，并用水冲洗包装袋内面两次，将冲洗液也倒入培养液中。随后，使用磁力搅拌器助溶，确保培养基完全溶解。

3.补加试剂：根据培养基包装袋上的说明，加入必要的试剂。这可能包括NaHCO3、HEPES以及非必需氨基酸等。这些试剂的添加量需严格按照说明进行，以确保培养基的营养成分平衡。

4.加抗生素：为了防止细菌污染，通常需要在培养基中加入一定量的抗生素。常见的抗生素包括青霉素和链霉素，其终浓度一般为100U/ml。根据所需的总体积，计算出所需的抗生素储备液量，并将其加入到培养基中。

5.调节pH值：加水到预定的体积（如1000ml），然后使用HCl或NaOH调节pH值到适当的范围，通常为7.2。pH值的准确性对于细胞的生长和增殖至关重要。

6.过滤除菌：使用适当的滤膜（如0.22um滤膜）对培养基进行过滤，以去除其中的细菌和其他微生物。过滤后的培养基应分装于小瓶中（如100或200ml），以便后续使用。过滤后，pH值可能会有所上升，通常上升0.1-0.3。

7.添加小牛血清：在临用前，需要向培养基中加入一定比例的小牛血清，通常为10%。小牛血清是细胞培养中常用的补充物，它提供了细胞生长所需的多种生长因子和营养成分。

应用^[4-5]

低限量EAGLE培养基可以用于利用单细胞测序技术分析乳腺癌肿瘤干细胞基因组突变特点

选用单细胞体外微球形成模型对乳腺癌肿瘤干细胞进行富集,之后利用MDA扩增技术对单细胞微球和未成球单细胞的基因组分别进行扩增,利用多重聚合酶链式反应(Multiplex Polymerase Chain Reaction,Multiplex PCR)技术构建文库,进行靶向测序,用以研究乳腺癌肿瘤干细胞基因组突变特点。

2.研究方法(1)(1)选用人乳腺癌细胞MDA-MB-231单细胞体外微球形成试验,在显微镜下分离单个MDA-MB-231细胞,接种于低粘附96孔板内,在无血清、补充成纤维细胞生长因子(basic Fibroblast Growth Factor,b FGF)、表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)、B-27细胞培养添加剂(B-27)的杜氏改良低限量EAGLE培养基:营养混合物F-12(Dulbecco’s Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12,DMEM/F-12)培养基中培养单细胞7-10天;(2)对体外所形成的微球进行干性相关表型的验证试验。(2)(1)选取2个非肿瘤干细胞与3个肿瘤干细胞,利用多重链置换扩增(Multiple Displacement Amplification,MDA)反应方法扩增其全基因组;(2)利用多重PCR技术(Multiplex PCR)对已知肿瘤热点突变靶区进行扩增建库测序;(3)寻找靶区内乳腺癌肿瘤干细胞存在高频突变的基因位点。(3)(1)对乳腺癌肿瘤干细胞高频突变进行基因富集分析。

参考文献

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