普卡那肽的合成

介绍

普卡那肽(plecana tide)由美国Synergy制药公司研发,是尿鸟苷蛋白(uroguanylin)的类似物，具有促尿钠排泄的鸟苷酸环化酶受体激动药的作用,能调节胃肠道中的酸碱离子，诱导液体转运进入胃肠道,增加胃肠道的蠕动,适用于治疗成人慢性特发性便秘。普卡那肽是含有双二硫键连接的16个氨基酸的环状多肽，它是鸟苷酸环化酶‑C肽的激动剂。

普卡那肽

合成

以往合成的缺点

目前普卡那肽合成方法主要分为一步成环和分步成环法：

一步成环法即为氨基酸经过固相逐级法拼接，其中两组Cys都属于统一保护基，切割树脂、经氧化成环一步完成两个二硫键S‑S的构建，得到普卡那肽粗品，通过纯化冻干得到普卡那肽。分步成环法即为两组Cys采用不同保护基，有选择的分步完成两个二硫键S‑S的构建，通过纯化冻干得到普卡那肽。

不管是一步成环还是分步成环，肽序合成过程异常困难，氨基酸的偶联效率随着链长的增加而降低，产生大量的杂质，加大了纯化分离杂质难度，同时环化后产品会不具有生物活性的异构体杂质峰，导致整体收率和纯度偏低，另外一步成环，无法定向选择二硫键的形成，造成多个杂质峰，无法有效的判断二硫键的正确构成。

新合成方法

为解决上述技术问题，宋亮[1]提供了一种普卡那肽的制备方法。本发明采用分步成环法和片段法合成普卡那肽，提升偶联效率，减少了杂质的产生，提高了粗肽的纯度和收率，通过目的性的选取氨基酸侧链保护基控制普卡那肽成环顺序，减少错误环化产生的无活性杂质，提高了成品纯度和总体收率。

具体步骤如下：将片段Boc‑Asn(Trt)‑Asp(OtBu)‑Glu(OtBu)‑Cys(Trt)‑Glu(OtBu)‑Leu‑OH(22.01g)、N,N‑二异丙基碳二亚胺(2.8mL)和1‑羟基苯并三唑(2.43g)加入DMF(150m L)中搅拌溶解活化，加入H‑Cys(Acm)‑Val‑Asn(Trt)‑Val‑Ala‑Cys(Trt)‑Thr(tBu)‑Gly‑Cys(Acm)‑Leu‑Wang Resin的反应柱中，在25‑30℃下反应2小时，通过Kaiser颜色测试监测反应的完成，反应完成后，排干溶剂并用DMF(3×150mL)和洗涤树脂，加入无水甲醇(3×150m L)收缩树脂，干燥得普卡那肽肽树脂。将所得粗肽加入10％乙腈水中溶解，浓度约为1mg/mL。使用氨水将溶液pH值调节至8‑9，搅拌直至完全溶解，向粗肽溶液中，加入10当量30％H2O2溶液。在室温下搅拌反应，通过HPLC监测反应进程，反应完成后，使用TFA将反应物料的p H值调节至5‑6终止反应，过滤得到单环肽粗肽溶液并纯化；将上述纯化后的溶液稀释至浓度0.5mg/ml，向反应物料中加入含碘(2当量)的乙腈溶液，直到溶液黄色持续存在，环化温度控制在20℃以下，通过HPLC监测反应进程。反应完成后，加入抗坏血酸终止至黄色溶液澄清，用醋酸调节p H至5。将反应液进行过滤取滤液，所得滤液即含有双环肽粗品；将上述实施例6收集得到纯度≥99％的普卡那肽双环肽溶液进行脱盐洗脱；将所得洗脱后的普卡那肽溶液旋蒸浓缩得到浓缩液，冷冻干燥后得到普卡那肽纯品(纯度99.70％)。

该方法采用分步成环法和片段法(片段合成法6+10策略)合成普卡那肽，降低了合成难度，提升偶联效率，分步成环法可以定向成环，确保成环顺序正确，两步成环过程中进行纯化，减少了环化过程中产生的难除杂质，减少了杂质的产生，提高了粗肽的纯度和收率，通过目的性的选取氨基酸侧链保护基控制普卡那肽成环顺序，减少错误环化产生的无活性杂质(例如无活性异构体杂质)，提高了成品纯度和总体收率。

参考文献

[1]宋亮,顾维炜,郭晨晨等.一种普卡那肽的制备方法[P].江苏省:CN117603312A,2024-02-27.