普卡那肽的合成
发布日期:2024/3/20 9:16:07
介绍
普卡那肽(plecana tide)由美国Synergy制药公司研发,是尿鸟苷蛋白(uroguanylin)的类似物,具有促尿钠排泄的鸟苷酸环化酶受体激动药的作用,能调节胃肠道中的酸碱离子,诱导液体转运进入胃肠道,增加胃肠道的蠕动,适用于治疗成人慢性特发性便秘。普卡那肽是含有双二硫键连接的16个氨基酸的环状多肽,它是鸟苷酸环化酶‑C肽的激动剂。
普卡那肽
合成
以往合成的缺点
目前普卡那肽合成方法主要分为一步成环和分步成环法:
一步成环法即为氨基酸经过固相逐级法拼接,其中两组Cys都属于统一保护基,切割树脂、经氧化成环一步完成两个二硫键S‑S的构建,得到普卡那肽粗品,通过纯化冻干得到普卡那肽。分步成环法即为两组Cys采用不同保护基,有选择的分步完成两个二硫键S‑S的构建,通过纯化冻干得到普卡那肽。
不管是一步成环还是分步成环,肽序合成过程异常困难,氨基酸的偶联效率随着链长的增加而降低,产生大量的杂质,加大了纯化分离杂质难度,同时环化后产品会不具有生物活性的异构体杂质峰,导致整体收率和纯度偏低,另外一步成环,无法定向选择二硫键的形成,造成多个杂质峰,无法有效的判断二硫键的正确构成。
新合成方法
为解决上述技术问题,宋亮[1]提供了一种普卡那肽的制备方法。本发明采用分步成环法和片段法合成普卡那肽,提升偶联效率,减少了杂质的产生,提高了粗肽的纯度和收率,通过目的性的选取氨基酸侧链保护基控制普卡那肽成环顺序,减少错误环化产生的无活性杂质,提高了成品纯度和总体收率。
具体步骤如下:将片段Boc‑Asn(Trt)‑Asp(OtBu)‑Glu(OtBu)‑Cys(Trt)‑Glu(OtBu)‑Leu‑OH(22.01g)、N,N‑二异丙基碳二亚胺(2.8mL)和1‑羟基苯并三唑(2.43g)加入DMF(150m L)中搅拌溶解活化,加入H‑Cys(Acm)‑Val‑Asn(Trt)‑Val‑Ala‑Cys(Trt)‑Thr(tBu)‑Gly‑Cys(Acm)‑Leu‑Wang Resin的反应柱中,在25‑30℃下反应2小时,通过Kaiser颜色测试监测反应的完成,反应完成后,排干溶剂并用DMF(3×150mL)和洗涤树脂,加入无水甲醇(3×150m L)收缩树脂,干燥得普卡那肽肽树脂。将所得粗肽加入10%乙腈水中溶解,浓度约为1mg/mL。使用氨水将溶液pH值调节至8‑9,搅拌直至完全溶解,向粗肽溶液中,加入10当量30%H2O2溶液。在室温下搅拌反应,通过HPLC监测反应进程,反应完成后,使用TFA将反应物料的p H值调节至5‑6终止反应,过滤得到单环肽粗肽溶液并纯化;将上述纯化后的溶液稀释至浓度0.5mg/ml,向反应物料中加入含碘(2当量)的乙腈溶液,直到溶液黄色持续存在,环化温度控制在20℃以下,通过HPLC监测反应进程。反应完成后,加入抗坏血酸终止至黄色溶液澄清,用醋酸调节p H至5。将反应液进行过滤取滤液,所得滤液即含有双环肽粗品;将上述实施例6收集得到纯度≥99%的普卡那肽双环肽溶液进行脱盐洗脱;将所得洗脱后的普卡那肽溶液旋蒸浓缩得到浓缩液,冷冻干燥后得到普卡那肽纯品(纯度99.70%)。
该方法采用分步成环法和片段法(片段合成法6+10策略)合成普卡那肽,降低了合成难度,提升偶联效率,分步成环法可以定向成环,确保成环顺序正确,两步成环过程中进行纯化,减少了环化过程中产生的难除杂质,减少了杂质的产生,提高了粗肽的纯度和收率,通过目的性的选取氨基酸侧链保护基控制普卡那肽成环顺序,减少错误环化产生的无活性杂质(例如无活性异构体杂质),提高了成品纯度和总体收率。
参考文献
[1]宋亮,顾维炜,郭晨晨等.一种普卡那肽的制备方法[P].江苏省:CN117603312A,2024-02-27.
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