T98G的应用

背景^[1-3]

T98G是一种源自人脑胶质瘤的细胞系。这种细胞系经常被用作生物医学研究中的模型系统，特别是在神经生物学、肿瘤学、药物筛选和基因治疗等领域。T98G细胞系的特点包括快速生长、易于培养和具有某些特定的基因表达模式。

T98G细胞系的来源可以追溯到1970年代，当时科学家们从一名患有恶性胶质瘤的患者的肿瘤组织中分离出了这些细胞。这些细胞在实验室条件下能够持续传代，并保持一定的遗传稳定性，因此被广泛用于科学研究。

在生物医学研究中，T98G细胞系常被用来模拟人脑胶质瘤的生长和侵袭行为，以及研究胶质瘤发生和发展的分子机制。此外，T98G细胞系也常被用作药物筛选的模型，以评估潜在抗癌药物对胶质瘤细胞的杀伤作用。

然而，值得注意的是，虽然T98G细胞系在研究中具有一定的代表性，但它并不能完全模拟真实的人体环境。因此，在将实验结果应用于临床之前，还需要进行更多的实验验证和临床研究。

T98G

T98G细胞培养操作

1)复苏T98G细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)T98G细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)T98G细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

T98G可以用于DUSP10基因敲降T98G细胞系构建及其对细胞功能的影响

探究了DUSP10在胶质瘤和正常脑胶质细胞中的表达差异,并通过慢病毒沉默DUSP10在胶质瘤细胞中的表达,分析DUSP10对胶质瘤细胞T98G增殖能力、迁移能力和凋亡的影响。

[方法]一.通过生物信息学相关知识,初步探究DUSP10在胶质瘤细胞和正常细胞中的表达差异,利用TCGA和CGGA数据库进行生存曲线分析,研究DUSP10与胶质瘤的相关性。

二. 运用RT-q PCR和Western blot技术对HAC/T98G/U251/U87细胞进行表达量检测,分别从基因和蛋白水平层面来验证DUSP10在各胶质瘤细胞中的表达水平差异。

三. 通过酶切,连接、转化、抽提等方法构建出具有沉默DUSP10作用的pLK0.1质粒载体,使用慢病毒转导技术实现对T98G细胞系的DUSP10 RNA进行干扰,设置荧光阳性对照组,验证病毒包装和转染情况,并用嘌呤霉素筛选出稳定转染慢病毒的T98G细胞株,运用RT-q PCR和Western blot方法分别从基因和蛋白水平来验证胶质瘤细胞T98G经干扰后的敲降的效果。

四. 将胶质瘤细胞T98G分为shRNA-blank组、shRNA-NC组shRNA-DUSP10-1组、shRNA-DUSP10-2组,使用Cell Counting Kit 8(CCK-8)试剂检测法、Transwell小室迁移测定、流式细胞仪检测等试验技术,对以上各组细胞生物功能进行检测,分析DUSP10对胶质瘤细胞T98G增殖、迁移、凋亡方面的影响。

五. 试验采用SPSS 18.0和Graph Pad Prism7软件进行统计分析和制图,P<0.05表示结果具有统计学意义。

[结果]DUSP10在不同的胶质瘤WHO分型中表达量存在差异,随着WHO分型的增高,DUSP10的表达量也随之升高(P<0.05),并在患者生存性分析中,与DUSP10低表达相比,DUSP10高表达呈现出低生存率趋势(P<0.05)。通过慢病毒转染T98G细胞,再经嘌呤霉素筛选与荧光对照组试验对照表明,慢病毒转染的细胞系构建成功。经Real-timePCR和WesternBlot试验检测,与shRNA-blank组和shRNA-NC组相比,shRNA-DUSP10-1组和shRNA-DUSP10-2组细胞DUSP10的表达下降(P<0.05),结果表明RNA干扰效果成功;CCK8试验检测并绘制各组细胞的生长曲线发现,沉默DUSP10后T98G的增殖活性在第二、三天明显下降(P<0.05);

通过Transwell法来检测各不同组T98G的迁移能力,我们发现shRNA-blank组和shRNA-NC组、shRNA-DUSP10-1组、shRNA-DUSP10-2组透过小室细胞均有意义,各组每个视野细胞分别为64±4个、61±5个、21±4个和19±4个,与空白对照组和阴性对照组相比,DUSP10两个干扰组的迁移细胞数显著减少,差距有统计学意义(p<0.01);经流式细胞技术检测细胞凋亡率结果显示:shRNA-blank组、shRNA-NC组shRNA-DUSP10-1组、shRNA-DUSP10-2组的晚期凋亡率分别为(4.79±0.68)%、(5.13±1.03)%和(8.94±0.7)%,(8.98±0.85)%,DUSP10干扰组的晚期凋亡率比空白组和阴性对照组明显增加,差距具有统计学意义(p<0.05).

参考文献

[1]Corrigendum to:CBTRUS Statistical Report:Primary Brain and Other Central Nervous System Tumors Diagnosed in the United States in 2013-2017.[J].Ostrom Quinn T;Patil Nirav;Cioffi Gino;Waite Kristin;Kruchko Carol;BarnholtzSloan Jill S.Neuro-oncology,2020

[2]How I treat anaplastic glioma without 1p/19q codeletion.[J].Berghoff Anna;;van den Bent Martin.ESMO open,2019

[3]Andrographolide inhibits hypoxia-induced hypoxia-inducible factor 1αand endothelin 1 expression through the heme oxygenase 1/CO/cGMP/MKP-5 pathways in EA.hy926 cells.[J].Lin Hung-Chih;;Su Shih-Li;;Lin Wan-Chun;;Lin Ai-Hsuan;;Yang Ya-Chen;;Lii Chong-Kuei;;Chen Haw-Wen.Environmental toxicology,2018

[4]Effects of interactions between common genetic variants and alcohol consumption on colorectal cancer risk.[J].Song Nan;;Shin Aesun;;Oh Jae Hwan;;Kim Jeongseon.Oncotarget,2018

[5]张书东.DUSP10基因敲降T98G细胞系构建及其对细胞功能的影响[D].昆明医科大学,2022.