H-4-II-E的应用

背景^[1-3]

H-4-II-E细胞系是一种来源于大鼠的肝细胞系，经常被用于毒理学和药物代谢研究。这种细胞系是由美国国立卫生研究院（NIH）的致癌研究所（NCI）建立的，并被广泛用于评估化学物质对肝脏的潜在毒性。

H-4-II-E细胞系来源于一只雌性Sprague-Dawley大鼠的肝脏肿瘤，经过连续传代培养，保持了稳定的遗传特性。这些细胞在培养条件下表现出典型的肝细胞形态和功能，如合成蛋白质、储存糖原和代谢药物等。

由于H-4-II-E细胞系具有与人体肝细胞相似的代谢酶活性，因此被广泛用于药物代谢和毒理学研究。这些细胞可以用于评估药物在肝脏中的代谢途径、代谢产物的生成以及药物对肝脏的潜在毒性。此外，H-4-II-E细胞系也可用于筛选潜在的抗癌药物和其他药物候选物。

与其他细胞系一样，H-4-II-E细胞系虽然具有一定的代表性，但并不能完全模拟真实的人体环境。因此，在将实验结果应用于临床之前，还需要进行更多的实验验证和临床研究。

H-4-II-E

H-4-II-E细胞系培养操作

1)复苏H-4-II-E细胞系：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)H-4-II-E细胞系传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)H-4-II-E细胞系冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

H-4-II-E细胞可以用于miR-200a在抑制成体肝干细胞恶性表型和功能中的调控作用及其机制研究

明确miR-200a在肝卵圆细胞系WB-F344及肝癌细胞系（BRL、H-4-II-E细胞，CBRH-7919，RH-35）中的表达水平，进而研究miR-200a外源性功能抑制对WB-F344细胞表型及功能的影响，最后探讨miR-200a调控WB-F344细胞表型及功能的具体分子机制。

【方法】1.分别选择大鼠肝卵圆细胞系WB-F344，大鼠正常肝上皮细胞系BRL以及大鼠肝癌细胞系H-4-II-E细胞，CBRH-7919，RH-35，利用qRT-PCR方法检测miR-200a在BRL、H-4-II-E细胞，CBRH-7919，RH-35中的表达水平，明确miR-200a在肝癌发生中的表达变化。

2. 构建慢病毒载体介导的miR-200a功能稳定抑制细胞系WB-anti-miR-200a及对照细胞系（BRL、H-4-II-E细胞，CBRH-7919，RH-35）WB-miR-NC，分别从miRNA水平、mRNA水平及蛋白水平进行转染效率及功能鉴定。

3. 检测WB-anti-miR-200a细胞中HCSC相关表型及功能：具体包括生长增殖能力及自我更新能力（细胞计数实验、悬浮培养克隆球形成实验）；凋亡水平变化（FITC-Annexin V-PI染色、Caspase3/7活性检测）；HCSC标志物表达及肝系分化情况（qRT-PCR方法检测EpCAM、CD133、ABCG2、CK19、AFP、ALB等分子）；细胞耐药能力（流式细胞术检测细胞与化疗药物共培养后凋亡水平）；体内致瘤能力（裸鼠皮下成瘤检测）。

4. 鉴定WB-anti-miR-200a细胞的EMT特征：光镜观察细胞形态变化；Transwell迁移实验检测细胞体外运动能力；western-blot方法检测E-cadherin、Vimentin、N-cadherin等EMT特征蛋白表达。

【结果】1.相对于WB-F344细胞及BRL细胞，miR-200a在3种H-4-II-E细胞，CBRH-7919，RH-35中的表达水平均明显降低（P＜0.01）。

参考文献

[1]Regulation of microRNAs in cancer metastasis[J].Juliette M.C.Bouyssou;;Salomon Manier;;Daisy Huynh;;Samar Issa;;Aldo M.Roccaro;;Irene M.Ghobrial.BBA-Reviews on Cancer,2014

[2]MicroRNA-200a and-200b Mediated Hepatocellular Carcinoma Cell Migration Through the Epithelial to Mesenchymal Transition Markers[J].Chin-Sheng Hung;;Hui-Hsiung Liu;;Jun-Jen Liu;;Chi-Tai Yeh;;Tung-Cheng Chang;;Chih-Hsiung Wu;;Yuan-Soon Ho;;Po-Li Wei;;Yu-Jia Chang.Annals of Surgical Oncology,2013(3)

[3]Modeling Pathogenesis of Primary Liver Cancer in Lineage-Specific Mouse Cell Types[J].ágnes Holczbauer;;Valentina M.Factor;;Jesper B.Andersen;;Jens U.Marquardt;;David E.Kleiner;;Chiara Raggi;;Mitsuteru Kitade;;Daekwan Seo;;Hirofumi Akita;;Marian E.Durkin;;Snorri S.Thorgeirsson.Gastroenterology,2013(1)

[4]Downregulated microRNA-200a promotes EMT and tumor growth through thewnt/β-catenin pathway by targeting the E-cadherin repressors ZEB1/ZEB2 in gastricadenocarcinoma[J].Ningning Cong;;Ping Du;;Anling Zhang;;Fajuan Shen;;Juan Su;;Peiyu Pu;;Tao Wang;;Jie Zjang;;Chunsheng Kang;;Qingyu Zhang.Oncology Reports,2013(4)

[5]刘杰.miR-200a在抑制成体肝干细胞恶性表型和功能中的调控作用及其机制研究[D].第四军医大学,2015.