PA317的应用

背景^[1-3]

PA317是一种逆转录病毒表达载体包装细胞系，由小鼠成纤维细胞系NIH3T3衍生而来。这种细胞系含有逆转录病毒的gag、pol和env等结构基因，但由于缺乏包装信号ψ，因此无法有效地包装编码这些基因的RNA。然而，当复制缺陷性的逆转录病毒表达载体导入包装细胞后，由于载体含有包装信号，因此可被包装成完整的病毒颗粒，并通过出芽方式释放到培养上清中。

PA317细胞系作为第二代逆转录病毒表达载体包装细胞系，被广泛用于基因治疗和基础研究中。它可以为病毒载体提供病毒包装所必需的结构蛋白，并含有反转录病毒4070A的ENV序列。通过PCR等方法可以检测到PA317细胞系中特定基因的表达和病毒包装的效果。

此外，PA317细胞系还用于制备特定的细胞复苏产品，如含有新霉素抗性基因的逆转录病毒表达载体。这些复苏产品可用于实验室研究中的细胞培养、药物筛选和基因治疗等实验。然而，需要注意的是，PA317细胞系只供进一步科研使用，不可应用于临床等其他方面。

PA317

pRb1细胞系培养操作

1)复苏pRb1细胞系：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)pRb1细胞系传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)pRb1细胞系冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

PA317可以用于过表达葡萄糖转运蛋白-2基因的INS-1细胞构建研究

葡萄糖转运蛋白-2基因逆转录病毒表达载体构建/包装及鉴定目的:构建GLUT-2基因逆转录病毒表达载体pL-GLUT2-SN,并于PA317细胞中进行包装,获取高滴度的稳定产毒细胞克隆PA317/GLUT-2,为GLUT-2基因稳定转染INS-1细胞奠定基础。

方法:(1)质粒pcB7/GLUT-2以EcoRI、BamH1双酶切,获得GLUT-2 cDNA,与同样酶切的逆转录病毒载体pLXSN在T4DNA连接酶作用下连接,构建成重组逆转录病毒表达载体pL-GLUT2-SN,经酶切及测序鉴定;(2)Lipofectamine2000介导pL-GLUT2-SN转染包装细胞PA317,分别以PCR、RT-PCR对PA317/GLUT-2细胞中GLUT-2基因的整合与转录进行检测。

结果:(1)构建的pL-GLUT2-SN重组载体经EcoRI、BamH1双酶切有1996bp的GLUT-2 cDNA及5.9kb的载体片段,GLUT-2 cDNA序列经测序证实正确;

(2) 所获稳定产毒细胞克隆PA317/GLUT-2,其最高病毒滴度可达7.1×105 CFU/mL;PA317/GLUT-2细胞RT-PCR扩增出158bp的目的片段;而PA317/pLXSN细胞检测结果为阴性,证实在PA317/GLUT-2细胞中已获得GLUT-2基因的转录。

结论:所获GLUT-2 cDNA序列正确,成功构建了高滴度的稳定产毒细胞克隆PA317/GLUT-2,为GLUT-2基因稳定转染INS-1细胞奠定了基础。

参考文献

[1]Anti-GAD antibody targeted non-viral gene delivery to islet beta cells[J].Ji Hoon Jeong;;Minhyung Lee;;Won Jong Kim;;James W.Yockman;;Tae Gwan Park;;Yong Hee Kim;;Sung Wan Kim.Journal of Controlled Release,2005(3)

[2]Insulin-producing cells derived from human pancreatic non-endocrine cell cultures reverse streptozotocin-induced hyperglycaemia in mice[J].M.Zhao;;S.A.Amiel;;M.R.Christie;;M.Rela;;N.Heaton;;G.C.Huang.Diabetologia,2005(10)

[3]Insulin secretion and GLUT-2 expression in undernourished neonate rats[J].Célia Lopes Da Costa;;Marta Sampaio De Freitas;;Anibal Sanchez Moura.The Journal of Nutritional Biochemistry,2004(4)

[4]Hepatic expression of the human insulin gene reduces glucose levels in vivo in diabetic mice model[J].F Ajamian;;TG Titok;;EM Suhorada;;TA Ruban;;M Reeben.Diabetes and Metabolism,2003(4)

[5]方芳.过表达葡萄糖转运蛋白-2基因的INS-1细胞构建研究[D].第三军医大学,2011.