胞苷是什么？有何作用？

性质

胞苷属于核苷的一种，是由胞嘧啶与核糖合成而成，两者之间由β-N1-配糖键相连。其为白色或类白色结晶性或粉末；溶于水，溶于酸和碱，微溶于乙醇，不溶于有机溶剂。

作用

胞苷是人体和动植物体内RNA的结构组成部分，在生物体内生理生化过程中起着重要的调节作用，具有多方面生理活性；同时，胞苷又是很多抗病毒、抗肿瘤和抗艾滋病药物的良好原材料。

一种生产胞苷的重组微生物

技术方案：

1.去除利用和降解胞苷的酶的编码基因使胞苷不再参与细胞中的代谢

首先为了使微生物能够积累胞苷，1）对细胞中利用胞苷合成其它嘧啶核苷酸的第一个酶（胞苷/尿苷激酶）的编码基因进行阻断或敲除，这样胞苷就不能被磷酸化成CMP，CMP能够进一步被用来合成CDP， CTP等等。2）在微生物还存在着一系列的酶，它们具有降解胞苷的能力。比如胞苷脱氨酶（EC 3.5.4.5），催化胞苷到尿苷的转化反应，核糖核苷水解酶（EC3.2.2.3）将胞苷水解成胞嘧啶和核糖。对这些基因进行敲除或阻断，使得胞苷能够积累。此外，位于微生物细胞膜上的核苷转运蛋白，如大肠杆菌的NupG/NupC，(Craig JE1994, MolMicrobiol.11(6):1159-68.），可将胞外的核苷转运至胞内。进一步对编码这些转运蛋白的基因进行敲除，就可使胞苷在胞外积累，同时也方便产品的纯化。

2.从CMP的去磷酸化来合成胞苷

大多野生型的生物都能生产多种磷酸化酶或核苷酶，如酸性磷酸化酶、碱性磷酸化酶和核苷酶，例如大肠杆菌产生酸性磷酸化酶（AphA）、碱性磷酸化酶(PhoA)、和核苷酶（UshA，YjjG, UmpH , UmpG， SurE，YfbR）(see http://ecocyc.org/ ）。无论是在胞内还是在周质空间，这些酶对核苷的特异性都不强，但是这些酶在鸟苷、腺苷和肌苷的微生物发酵生产中担任着非常重要的角色。同样的，在重组细胞中这些酶也可以用来生产胞苷的。

另一方面，自然界生物中存在着对特定的核苷酸具有特异性的磷酸化酶或核苷酶， 比如工业上在重组大肠杆菌中生产Beta-胸苷就是利用对dTMP（脱氧胸苷单磷酸）具有特异性的dTMP磷酸化酶（TMPase，US专利 5213972）将dTMP去磷酸化来合成beta-胸苷的。在自然界中同样也存在对CMP有特异性的磷酸化酶或核苷酶（在这里统称为CMPase）。例如链球菌来源的S5NA （Zheng 2015 JBC 290, 31126-31137），酿酒酵母来源的PHM8（Kuznetsov2015 JBC 290, 18678-18698）,人体白细胞来源的核苷酸酶PN-1（Chiarelli 2004,Redcells 105, 3340-3345），果蝇来源的CG3362(Buschmann J 2013,J Biol Chem.,288(4):2441-51.)，PBS2 噬菌体来源的TMPase（Price AR1973,J Biol Chem.248(4):1372-80.），家鼠（murine）来源的mdNT1（Rampazzo C2000,J Biol Chem.Feb 25;275(8):5409-15）以及mdNT2 (Mootha VK2003,Cell.115(5):629-40.)，大肠杆菌来源的YjjG, YfdR, SurF，UmpG（Proudfoot M2004, J Biol Chem. 279(52):54687-94. ），UshA（Innes D2001, J BasicMicrobiol. 41(6):329-37.），UmpH(Tremblay LW 2006,Biochemistry.45(4):1183-93)，AphA（Passariello C2006, Biochim Biophys Acta. 2006 Jan;1764(1):13-9. ），PhoA(Engstrom1961,Biochim Biophys Acta 52;36-48. ) 等等 。

这些对CMP具有特异性的CMPase或/和它们同源的酶的编码基因可以用DNA合成的方法获得，也可以直接相应的生物中提取的mRNA 为模板，通过PCR的方法获得。因此，将上述获得的任何一个基因在重组细胞中进行表达，成功表达的CMPase就可以在重组细胞中以CMP为底物来产生CdR，显著增加胞苷的产量。

为了进一步获得特异性更高的某一CMPase，可以通过蛋白质工程的技术，也可以获得具有对CMP高特异性的CMPase突变体，用来在重组细胞中产生大量的CdR（如，通过蛋白质工程来提高芽孢杆菌中支链淀粉酶的热稳定性（Chang 2016,MPLoS One. 11(10):e0165006. ））。

3.增强细胞中CMP的供给

在生物中，胞苷单磷酸并不是嘧啶核苷酸从头合成途径中的中间体，它只是嘧啶核苷酸的补救合成中的中间体。它可能是RNA降解后的产物，细胞降解RNA后，所产生的CMP，被CMP激酶（Cmk）催化生成胞苷二磷酸 （EC 2.7.4.14 ， EC2.7.4.25），后者可以进一步磷酸化合成CTP， 或经核糖核酸还原酶用来合成脱氧胞苷二磷酸 （dCDP）。dCDP 是脱氧核糖核苷酸（DNA）合成的原料，脱氧胞苷三磷酸（dCTP）和脱氧胸苷三磷酸（dTTP）的前体物。

为了增加胞苷的合成，重组细胞具有持续的胞苷单磷酸的供给就很重要。为此1）首先就必须使细胞中缺少CMP激酶（Cmk），使CMP专门用来合成胞苷。2）其次是在重组细胞中表达或超量表达CTP和CDP磷酸化酶或相应的核苷酸酶, 从而增加CMP在胞内的浓度。有关的CTP和CDP磷酸化酶或相应的核苷酶可能并不存在于所有的、非基因改造过的细胞中。目前已知的能够催化CTP水解成CMP的磷酸化酶或核苷酶报道的有，大肠杆菌来源的NudG（O’Handley, et al 2000 JBC 276,5421-5426）, 分枝杆菌来源的Mut2（Sang 2013 ASM 195,1552-1560）, 枯草杆菌来源的Maf 蛋白-BSU28050（Tchigvintsev 2013 Chemistry &Biology 20,1386-1398），Deinococcus radiodurans来源的DR_0079(Buchko GW2008,Biochemistry. 47(25):6571-82.)，大肠杆菌来源的NudI（Xu W2006, J Biol Chem.281(32):22794-8.）,大肠杆菌来源的MazG(Zhang J2002, J Bacteriol.184(19):5323-9.),大肠杆菌来源的NudB（Suzuki Y1974, J Biol Chem.249(8):2405-10.）,大肠杆菌来源的PhnM（Kamat SS2011, Nature.480(7378):570-3.）,大肠杆菌来源的RppH（Deana A2008,Nature.451(7176):355-8. ）等等。

4.解除嘧啶核苷合成的反馈抑制，增加嘧啶核苷合成的代谢流和CdR的产量

嘧啶核苷酸合成途径催化第一步由氨基甲酰磷酸合成酶催化合成氨基甲酰磷酸。该酶的编码基因carAB分别受到代谢终产物嘌呤、嘧啶以及精氨酸的反馈阻遏作用（DevroedeN2006, J Bacteriol.188(9):3236-45.），相应阻遏蛋白分别为PurR, PepA, ArgR（Kim2015. Microb Cell Fact 14:98），本发明通过对阻遏蛋白编码的基因purR, pepA,argR的敲除，进而解除了CarAB的转录的抑制，加快了氨基甲酰磷酸合成。同时氨基甲酰磷酸合成酶本身也会受到UMP的反馈抑制，根据文献报道（Delannay S1999，J Mol Biol. 286(4):1217-28），将该酶的一个亚单位（CarB）的第948位氨基酸-丝氨酸突变成苯丙氨酸(S948F)就可有效解除UMP的抑制作用，本发明通过在染色体上对carB基因进行突变，获得携带编码CarB (S948F) 突变基因的重组菌株。

嘧啶核苷酸合成途径催化第二步是由天冬氨酸氨甲酰基转移酶催化合成氨基甲酰天冬氨酸。该酶由一个起调控作用的亚基（PyrI）和一个起催化亚基(PyrB) 组成，该酶在CTP浓度高的时候，CTP结合PyrI从而降低酶的活性。然而如果将编码天冬氨酸氨甲酰基转移酶调控亚基破坏掉，如将其编码基因的敲除，就解除终产物CTP对对其的反馈阻遏作用(Coudray L 2009, Bioorg Med Chem. 17(22):7680-9) 。

嘧啶核苷酸合成途径中pyrE编码乳清酸核糖磷酸转移酶，催化乳清酸合成乳清酸单磷酸，大肠杆菌W3110宿主菌中pyrE基因上游rph基因终止密码子附近存在移码突变（KajFrank Jensen1993, Journal Of Bacteriology,3401-3407.），导致部分rph基因转录无法终止，进而影响下游pyrE基因的表达，导致宿主菌中乳清酸的积累。pyrH编码的UMP激酶，催化UMP磷酸化合成UDP，但该酶受到其产物UDP的反馈抑制。对该酶第93位的天冬氨酸到丙氨酸的突变(D93A)能够有效解除相应的反馈抑制作用（Meyer P2008, J Biol Chem.283(51):36011-8.）。pyrG编码CTP合酶，催化UTP合成CTP，但该酶受到其产物CDP的反馈抑制，对该酶第160位天冬氨酸到谷氨酸(D160E)，或第162位谷氨酸到丙氨酸(E162A)或第168位谷氨酸到赖氨酸(E168K)的突变可有效解除CDP对其反馈抑制作用（Zhu2014,ProteinEngineering, Design & Selection 27(7 ). 225–233）。

另外在嘧啶核苷酸合成中，核糖是通过核糖磷酸焦磷酸为前体物合成到核苷上的，核糖磷酸焦磷酸激酶（Prs）催化5-磷酸核糖与ATP反应合成核糖磷酸焦磷酸PRPP。但是大肠杆菌来源的核糖磷酸焦磷酸激酶受到ADP的反馈抑制，而 Prs 上的第128位的天冬氨酸到丙氨酸的突变(D128A)可有效解除ADP对其反馈抑制作用(Shimaoka 2007 J BiosciBioeng 103(3):255-61.)。

参考文献

CN106754602A