NCI-H929的应用

背景^[1-3]

NCI-H929是一种人骨髓瘤细胞系，通常用于科学研究和实验室环境中的细胞培养。这种细胞系具有淋巴母细胞样的形态特性，并呈悬浮生长。NCI-H929细胞系主要用于人骨髓瘤疾病的研究，可以帮助科学家们更好地理解该疾病的发病机制和治疗方法。

在细胞培养中，NCI-H929细胞需要特定的培养基来支持其生长和繁殖。常用的培养基包括RPMI-1640基础培养基，并添加0.05mMβ-mercaptoethanol、10%的胎牛血清（FBS）和1%的青霉素/链霉素（P/S）等成分。此外，细胞的培养条件也需要严格控制，包括气相（空气95%，CO2 5%）和温度（37℃）等。

在实验室环境中，NCI-H929细胞系还可以用于其他实验，如细胞增殖实验、药物筛选实验等。这些实验需要特定的试剂和操作步骤，并需要遵循细胞培养的基本原则和注意事项，以确保实验结果的准确性和可靠性。

NCI-H929

NCI-H929细胞系培养操作

1)复苏NCI-H929细胞系：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)NCI-H929细胞系传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)NCI-H929细胞系冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

NCI-H929可以用于NCI-H929细胞系中CD20+与CD20-细胞具有不同的生物学特性及蛋白表达谱

NCI-H929细胞系中CD20+与CD20-细胞具有不同的生物学特性及蛋白表达谱

研究目的：1.从NCI-H929细胞系中分选CD20+和CD20-细胞，明确两种细胞克隆形成能力及分化能力的差异。

2. 探讨CD20+和CD20-的NCI-H929细胞蛋白表达谱的差异，验证其在mRNA和蛋白水平上的表达。

3. 选择影响CD20+细胞增殖的关键差异蛋白，抑制其功能，探讨对CD20+细胞增殖能力的影响。

研究方法：1.CD20+和CD20-的NCI-H929细胞分选取对数生长期的NCI-H929细胞，制备单细胞悬液，每107个细胞加免疫磁珠分选缓冲液80μl，随后加阻断剂20μl，4-8℃孵育10min，然后加CD20磁珠抗体20μl，4-8℃孵育15min，免疫磁珠分选缓冲液清洗细胞，将免疫磁珠抗体孵育的细胞加入免疫磁珠分选MS柱中，分选CD20+和CD20-细胞。采用流式细胞仪检测NCI-H929细胞和分选后的CD20+和CD20-细胞的免疫表型。

2. CD20+和CD20-细胞的克隆形成及分化能力取分选的CD20+和CD20-细胞，制备细胞悬液，培养于细胞克隆培养基中，培养基中细胞终浓度为1×103/mL，置入37℃5%CO2培养箱中培养，14-21天后观察细胞克隆数，40个细胞记为1个克隆，计算形成率，检测CD20+和CD20-细胞的克隆形成能力。取克隆形成细胞，制成细胞悬液，重新接种于克隆培养基中，检测克隆形成情况，根据上述方法，再进行3次重新接种，观察实验细胞的自我更新能力。取分选的CD20+NCI-H929细胞，加入培养基中，置于孵箱中培养，2周后，收集培养细胞，制成细胞悬液，分别加入抗人CD20、CD45、CD38和CD138抗体，流式细胞术的方法检测CD20+细胞抗原表达。

3. 差异蛋白筛选取分选的CD20+和CD20-细胞，总蛋白试剂盒提取细胞总蛋白，加入12%SDS-PAGE凝胶中进行电泳，将两组的蛋白质胶图进行分析后，将各组的所有条带分为10部分切下，每块切成直径2mm的小粒。萃取胶粒中蛋白质，使用胰酶溶液进行酶解，获得肽段干粉。TMT标记后，应用高效液相色谱分离与质谱鉴定两组间差异蛋白，Sequest软件鉴定筛选的差异蛋白。选取筛选的差异蛋白，应用在线数据库PANTHER(http://www.pantherdb.org/)对差异蛋白进行分类，应用人生物信息数据库STRING9.05(http://string-db.org/)分析差异蛋白之间的相互作用，筛选对CD20+细胞生物学特性具有重要影响的蛋白质。

结果：1.CD20+和CD20-的NCI-H929细胞分选用流式细胞术检测H929细胞抗原表达发现，H929细胞表达CD38、CD138，不表达CD45；CD20+细胞的比例很低，且不稳定，约为0.1-1%，CD20-的骨髓瘤细胞的比率约为99-99.9%。分选的CD20+细胞表达CD20、CD45和CD38，CD138表达减弱。分选的CD20-细胞表达CD38、CD138，不表达CD20、CD45。

参考文献

[1]CD138-negative clonogenic cells are plasma cells but not B cells in some multiple myeloma patients.[J].Hosen N;;Matsuoka Y;;Kishida S;;Nakata J;;Mizutani Y;;Hasegawa K;;Mugitani A;;Ichihara H;;Aoyama Y;;Nishida S;;Tsuboi A;;Fujiki F;;Tatsumi N;;Nakajima H;;Hino M;;Kimura T;;Yata K;;Abe M;;Oka Y;;Oji Y;;Kumanogoh A;;Sugiyama H.Leukemia,2012

[2]The peripheral CD138+population but not the CD138?population contains myeloma clonogenic cells in plasma cell leukaemia patients[J]..British Journal of Haematology,2012(5)

[3]Factors Influencing the Abundance of the Side Population in a Human Myeloma Cell Line[J].Sui-Lin Mo;;Jia Li;;Yen S.Loh;;Ross D.Brown;;Adrian L.Smith;;Yuling Chen;;Douglas Joshua;;Basil D.Roufogalis;;George Q.Li;;Kei Fan;;Michelle C.H.Ng;;Daniel Man-yuen Sze;;Ignazio Majolino.Bone Marrow Research,2011

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