稳定细胞系构建

背景^[1-7]

稳定细胞系构建是将外源质粒DNA整合到宿主细胞染色体上，使宿主细胞可长期表达目的蛋白，称稳定细胞系。高质量的稳定细胞系在生物学研究中扮演着非常重要的角色，包括基因功能研究、重组抗体、药物开发等。

技术原理：

1. 脂质体转染后，单克隆筛选稳定细胞株。脂质体转染：在转染24小时后，消化细胞并计数。将细胞种到96孔板，保证每个孔2-3个细胞，这样才能得到单克隆。待细胞贴壁后，加入抗生素筛选。筛选时间和浓度视细胞而定。一般G418一个星期作用，嘌呤霉素2-3天。脂质体法筛单克隆时间较长，且效率低，大概只有1%。

2.逆转录病毒，慢病毒转染，筛选稳定细胞株。

病毒转染：先要用包装细胞，一般为293细胞，包装出病毒，再用病毒转染目的细胞。包装病毒视不同类型的病毒而定，一般要3-5天的时间。包装好的病毒要测滴度，根据滴度决定转染目的细胞的病毒量。转染目的细胞1-2天后加抗生素筛选得到稳定细胞株。病毒转染得到稳定细胞株的效率高，只是步骤繁琐。

技术流程：

1. 载体构建-目的基因过表达载体的构建。

2. 病毒包装-表达载体、辅助质粒共转染293FT细胞，收集病毒上清，纯化和浓缩病毒颗粒。若选择转染，则跳过此步。

3. 转染、转导-电转染或转染试剂（脂质体等）进行细胞转染，或病毒转导

4. 筛选-根据表达载体的筛选基因选择药物进行筛选，如嘌呤霉素、G418等

5. 扩大培养-将筛选出的单克隆细胞进行扩大培养。

6. 鉴定-PCR、Q-PCR、western等从DNA、mRNA、蛋白水平进行检测。

应用^[8][9]

1.用于基因功能研究

在H5N1型禽流感NS1基因在HEK293细胞中的表达及稳定细胞系的构建的研究中将H5N1型禽流感病毒NS1(non-structural protein 1)基因插入pEGFP-N1真核表达载体中,获得重组质粒pNS1-EGFP,经酶切鉴定并测序后,去内毒素提取pNS1-EGFP质粒,在脂质体转染试剂作用下将pNS1-EGFP质粒转染HEK293细胞,利用倒置荧光显微镜、FCM和Western blot 3种方法检测NS1-EGFP融合蛋白的表达,利用极限稀释的方法获取单细胞,并利用G418抗性筛选获取稳定细胞系。

结果显示,NS1基因正确插入pEGFP-N1真核表达载体,NS1-EGFP融合蛋白读码框架正确;3种检测方法表明,NS1-EGFP融合蛋白在HEK293细胞中能够表达;pEGFP-N1和NS1-EGFP稳定细胞系流式细胞仪检测,阳性率分别为95.74%和96.10%,Western blot检测结果发现,HEK293空白细胞和pEGFP-N1稳定细胞系未见任何条带,NS1-EGFP稳定细胞系在51 000处见特异性条带,综上说明稳定细胞系构建成功。

2. 重组蛋白开发

在白细胞介素-35慢病毒表达载体的构建及稳转A549细胞系的建立的实验中构建过表达白细胞介素（IL）-35的慢病毒载体,包装慢病毒并感染肺癌细胞A549建立过表达IL-35的A549稳定细胞株,为研究IL-35在肺癌发生发展中的作用奠定基础。

方法根据基因序列及所用载体序列设计用于无缝克隆的引物序列,用聚合酶链式反应（PCR）扩增IL-35基因,EcoRⅠ和Bam HⅠ酶切PCR产物及载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro,经载体重组、转化、PCR鉴定和测序鉴定等获得重组质粒。将筛选出的重组慢病毒质粒与包装质粒共转染HEK-293T细胞,收取病毒浓缩液并检测其滴度。病毒浓缩液感染A549细胞,用Real-time PCR和Western blot方法检测稳转细胞系中IL-35的表达。

参考文献

[1]Effective inhibition of mRNA accumulation and protein expression of H5N1 avian influenza virus NS1 gene in vitro by small interfering RNAs[J].Hanwei Jiao,Li Du,Yongchang Hao,Ying Cheng,Jing Luo,Wenhua Kuang,Donglin Zhang,Ming Lei,Xiaoxiao Jia,Xiaoru Zhang,Chao Qi,Hongxuan He,Fengyang Wang.Folia Microbiologica.2013(4)

[2]Detection of antibodies to the nonstructural protein(NS1)of influenza A virus allows distinction between vaccinated and infected horses[J].H Ozaki,T Sugiura,S Sugita,H Imagawa,H Kida.Veterinary Microbiology.2001(2)

[3]Pathogenesis of and immunity to avian influenza A H5 viruses[J].J.M.Katz,X.Lu,A.M.Frace,T.Morken,S.R.Zaki,T.M.Tumpey.Biomedicine&Pharmacotherapy.2000(4)

[4]Influenza A Virus Lacking the NS1 Gene Replicates in Interferon-Deficient Systems[J].Virology.1998(2)

[5]Influence of host species on the evolution of the nonstructural(NS)gene of influenza A viruses[J].Yoshihiro Kawaoka,Owen T Gorman,Toshihiro Ito,Krisna Wells,Ruben O Donis,Maria R Castrucci,Isabella Donatelli,Robert G Webster.Virus Research.1998(2)

[6]Interleukin-35 Limits Anti-Tumor Immunity[J].Meghan E.Turnis,Deepali V.Sawant,Andrea L.Szymczak-Workman,Lawrence P.Andrews,Greg M.Delgoffe,Hiroshi Yano,Amy J.Beres,Peter Vogel,Creg J.Workman,Dario A.A.Vignali.Immunity.2016(2)

[7]IL-35 promotes pancreas cancer growth through enhancement of proliferation and inhibition of apoptosis:Evidence for a role as an autocrine growth factor[J].Michael B.Nicholl,Chelsea L.Ledgewood,Xuhui Chen,Qian Bai,Chenglu Qin,Kathryn M.Cook,Elizabeth J.Herrick,Alberto Diaz-Arias,Bradley J.Moore,Yujiang Fang.Cytokine.2014

[8]王红均,张其彬,伍莉,陈吉轩,帅学宏,丁孟建,黄庆洲,焦寒伟.H5N1型禽流感NS1基因在HEK293细胞中的表达及稳定细胞系的构建[J].中国兽医学报,2018,38(11):2125-2130.

[9]闫丹,薛文华,孔祥祯,田鑫,阚全程.白细胞介素-35慢病毒表达载体的构建及稳转A549细胞系的建立[J].中国临床药理学杂志,2018,34(18):2159-2163.