人食管鳞癌细胞的应用

背景^[1-3]

KYSE-410是一种人食管鳞癌细胞系，来源于一名51岁男子的颈段食管切除的低分化侵袭性食管鳞状细胞癌（肿瘤侵入外膜明显）。这种细胞系过表达hast-1（肝素结合生长因子）和cyclin D1。KYSE-410细胞系被广泛用于食管癌的研究，包括发病机制、药物筛选以及治疗方法的研究。

由于KYSE-410细胞系是从一名男性患者的肿瘤中建立的，因此在生物医学研究中，这种细胞系可以作为模拟人体食管癌的模型，有助于深入了解食管癌的生物学特性和发病机制。同时，KYSE-410细胞系也可以用于药物筛选和细胞治疗等研究，以评估新药物或治疗方法对食管癌的疗效和潜在作用机制。

然而，需要注意的是，KYSE-410细胞系是从一名患者的肿瘤中建立的，因此可能存在一定的个体差异和遗传背景差异。因此，在实验结果解释和应用时需要考虑这些因素，并进行充分的实验验证和临床前研究。

KYSE-410(人食管鳞癌细胞)

KYSE-410(人食管鳞癌细胞)培养操作

1)复苏KYSE-410(人食管鳞癌细胞)：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)KYSE-410(人食管鳞癌细胞)传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)KYSE-410(人食管鳞癌细胞)冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

KYSE-410(人食管鳞癌细胞)可以用于TM4SF1通过与Integrinα6相互作用促进食管鳞癌转移

①探讨四跨膜蛋白超家族成员1(Transmembrane-4 L-six family member-1,TM4SF1)在食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)中的表达及临床意义。②研究TM4SF1调控ESCC转移的分子机制。

方法:首先利用生物信息学方法,通过TNM plot在线数据库分析食管癌(esophageal cancer,EC)患者的肿瘤组织(tumor,T)及正常组织(normal,N)中TM4SF1基因的表达差异。收集35例ESCC患者的新鲜组织标本,采用蛋白质免疫印迹(western blot,WB)和实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)分析TM4SF1在蛋白和mRNA水平的表达差异。收集109对ESCC患者的组织石蜡标本,通过免疫组织化学染色(immunohistochemistry,IHC)检测TM4SF1的表达,根据TM4SF1表达情况分为高表达组和低表达组,并分析其与ESCC患者临床病理资料的相关性,多因素COX比例风险回归模型分析ESCC患者预后不良的危险因素。其次,利用WB方法检测人类食管上皮细胞(human esophageal epithelium cells,HEEC)和不同ESCC细胞系(TE-1,KYSE-510,KYSE-410(人食管鳞癌细胞)和Eca109)中TM4SF1的表达差异。

构建TM4SF1过表达、敲低以及敲低后再恢复表达的稳转细胞株。利用细胞粘附实验检测肿瘤细胞与不同细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的粘附能力,Transwell实验观察层黏连蛋白(laminin)包被的不同食管癌细胞迁移能力。接下来,通过免疫共沉淀(immunoprecipitation,IP)检测与TM4SF1存在相互作用的受体蛋白,WB检测TM4SF1干扰表达后下游信号通路的变化,再次采用WB和Transwell实验验证TM4SF1-整合素(integrin)复合物影响的下游信号通路和细胞迁移功能。最后,利用IHC和Kaplan-Meier曲线检测并分析TM4SF1、integrinα6和下游关键信号通路转导分子表达情况及其与ESCC患者生存预后的关系。

结果:①TM4SF1在ESCC组织中的表达情况及其与临床病理资料的关系:通过TNM plot在线数据库分析发现T组中TM4SF1基因表达水平明显高于N组(P=1.42e-06)。在ESCC患者新鲜组织标本和石蜡标本中,T组TM4SF1的表达水平明显高于N组(P<0.001),并与患者的临床TNM分期(P=0.016)、淋巴结转移(P=0.027)、分化程度(P=0.031)和肿瘤大小(P=0.023)明显相关,并且TM4SF1高表达是ESCC患者预后不良的危险因素(P=0.006)。

②体外研究TM4SF1表达对ESCC细胞迁移能力的影响:首先WB检测TM4SF1在HEEC和不同ESCC细胞系中表达,结果显示内源性TM4SF1在Eca109细胞株中相对低表达,在KYSE410细胞株中相对高表达。基于此,我们成功构建了TM4SF1过表达的Eca109细胞(TM4SF1-Overexpression,TM4SF1-OE)、敲低表达的KYSE-410(人食管鳞癌细胞)细胞(TM4SF1-sh#1,TM4SF1-sh#2)及敲低后再恢复TM4SF1表达的KYSE-410(人食管鳞癌细胞)细胞(TM4SF1-Rescue,TM4SF1-Res)。细胞粘附实验发现:Laminin介导的细胞粘附能力在TM4SF1-OE细胞中明显增强。Transwell实验结果显示:在laminin包被条件下,与对照组(contro1con)细胞相比,TM4SF1-OE组细胞的迁移能力明显增强(P<0.001),TM4SF1-sh组细胞的迁移能力明显降低(P<0.01),并且这种抑制作用伴随TM4SF1表达的恢复而逆转(P<0.01)。

参考文献

[1]Effect and mechanism of downregulating the long-chain noncoding RNA TM4SF1-AS1 on the proliferation,apoptosis and invasion of gastric cancer cells.[J].He Chengzhi;Qi Wenjing;Wang Zhihui.World journal of surgical oncology,2021

[2]TNMplot.com:A Web Tool for the Comparison of Gene Expression in Normal,Tumor and Metastatic Tissues[J].Barthaáron;Gy?rffy Balázs.International Journal of Molecular Sciences,2021

[3]Global Cancer Statistics 2020:GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries[J].Sung Hyuna;Ferlay Jacques;Siegel Rebecca L.;Laversanne Mathieu;Soerjomataram Isabelle;Jemal Ahmedin;Bray Freddie.CA:A Cancer Journal for Clinicians,2021

[4]TM4SF1 promotes EMT and cancer stemness via the Wnt/β-catenin/SOX2 pathway in colorectal cancer.[J].Tang Qiang;Chen Jinhuang;Di Ziyang;Yuan Wenzheng;Zhou Zili;Liu Zhengyi;Han Shengbo;Liu Yanwei;Ying Guoguang;Shu Xiaogang;Di Maojun.Journal of experimental&clinical cancer research:CR,2020

[5]郝鑫.TM4SF1通过与Integrinα6相互作用促进食管鳞癌转移[D].扬州大学,2023.