D407的应用

背景^[1-3]

D407是一种源自人视网膜色素上皮细胞的系，通常用于研究眼部疾病和药物筛选。这些细胞在培养条件下可以保持其特定的形态和功能，使它们成为研究视网膜疾病和测试新药物的有用工具。D407细胞系在体外培养中表现出特定的生物学特征，例如增殖能力和对特定药物的反应。这些特性使D407成为眼科药物研发中的重要工具，有助于更好地理解视网膜疾病的发病机制并开发新的治疗方法。

D407

D407细胞系培养操作

1)复苏D407细胞系：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)D407细胞系传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)D407细胞系冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

D407可以用于HIV-1进入视网膜色素上皮细胞及其传播的研究

通过体外培养的D407细胞,建立体外的视网膜上皮细胞屏障模型。利用流式细胞技术、western blotting、共聚焦显微镜等多种方法研究病毒进入D407细胞,采用化学抑制剂的方法探讨病毒进入D407细胞的具体机制,采用PCR技术检测病毒在D407细胞中的整合作用,利用溶酶体的标记物和溶酶体中的蛋白酶抑制剂等检测病毒在细胞内的转运过程；最后通过共培养的方式来检测病毒在细胞-细胞间的传播。

本文旨在探讨HIV-1进入视网膜色素上皮细胞的机制以及病毒进入细胞后发生的分子事件。预期阐明病毒致视网膜疾病的机制及病毒在视网膜中可能建立的潜伏感染,寻找潜在的药物治疗靶点。

研究方法：1.克隆病毒的制备及其感染力的检测1)将SF162(R5受体嗜性)病毒全长基因的质粒和NL4-3(X4受体嗜性)病毒全长基因的质粒,分别转染至293TX细胞中制备感染性克隆病毒。2)将转染得到的HIV-1克隆病毒分别稀释2、4、8、16、32、64倍六个浓度,100分μl/孔,加入到提前12h铺好的TZM-B1细胞的96孔板中,48 h后用luciferase报告基因检测试剂盒检测。

2. 检测D407细胞表面受体的表达1)流式细胞仪检测：D407铺板36 h后,用0.025%的EDTA消化细胞,PBS重悬,1μg/ml anti-CD4、anti-CCR5、anti-CXCR4的抗体4℃孵育1 h,1μg/ml的鼠源性二抗4℃孵育40min,PBS重悬后,流式细胞仪检测。2)RT-PCR检测：依据基因组试剂盒的说明书,提取D407细胞的基因组,参考文献设计CD4、CXCR4、CCR5等受体基因的引物序列,基因组直接进行RT-PCR实验,用7500软件查看各样品的溶解曲线和循环数。

3. 检测HIV-1能否感染D407细胞1)ELISA检测(以R5受体嗜性的病毒为例)：将病毒处理CEMX1745.25M7细胞和D407细胞6 h,胰酶消化收集细胞,PBS洗涤3次,培养基重悬,1×105个/孔铺板,分别在第1、3、5、7天取500μ1上清裂解,用ELISA检测上清中p24的含量。

4. 检测HIV-1能够进入D407细胞1)流式细胞仪检测：将D407细胞2×105个/孔铺板,12 h后加入EGFP标记的HIV-1,37℃孵育2 h,胰酶消化、重悬,PBS混悬均匀,上机检测。2)Western blotting检测：将D407细胞2×105个/孔铺板,24 h后分别加入不同的HIV-1,37℃孵育2 h,胰酶消化、重悬、离心,PBS洗涤3次,用细胞裂解液RIPA裂解、收集蛋白,检测核心抗原p24蛋白。3)共聚焦显微镜检测：将D407细胞2×105个/孔铺板,24 h后分别加入EGFP标记的克隆病毒,37℃孵育1h,PBS洗涤3次,加入2 gM的DiI(染细胞膜的红色荧光染料)染色10min,PBS洗涤3次,4%的多聚甲醛固定15 min,PBS洗涤3次,DAPI染细胞核,在荧光共聚焦显微镜上观察不同荧光所在的位置。

5.HIV-1进入D407细胞的机制研究1)流式细胞仪检测：将D407细胞2×105个/孔铺板,孵育24 h后,分别加入不同的化学抑制剂处理细胞1 h,加入EGFP标记的R5受体嗜性的克隆病毒,处理1 h,胰酶消化、重悬,PBS混悬均匀,上机检测。2)Western blotting检测：将D407细胞2×105个/孔铺板,孵育24 h后,加入不同浓度的各种抑制剂,处理1 h,加入克隆病毒,处理1 h,胰酶消化、重悬,离心,PBS洗涤3次,用细胞裂解液RIPA裂解、收集蛋白,检测核心抗原p24蛋白。

参考文献

[1]HPV and Anal Cancer in HIV-Infected Individuals:A Review[J].Maarten F.Schim van der Loeff;;Sofie H.Mooij;;Oliver Richel;;Henry J.C.Vries;;Jan M.Prins.Current HIV/AIDS Reports,2014(3)

[2]Membrane organization of virus and target cell plays a role in HIV entry[J].Fabrice Dumas;;Pascal Preira;;Laurence Salomé.Biochimie,2014

[3]HIV infection:epidemiology,pathogenesis,treatment,and prevention[J].Gary Maartens;;Connie Celum;;Sharon R Lewin.The Lancet,2014

[4]Influenza entry pathways in polarized MDCK cells[J].Yueting Zhang;;Gary R.Whittaker.Biochemical and Biophysical Research Communications,2014

[5]寻添荣.HIV-1进入视网膜色素上皮细胞及其传播的研究[D].南方医科大学,2016.