DAMI细胞:人巨核细胞白血病细胞系的应用

背景^[1-3]

DAMI细胞:人巨核细胞白血病细胞系是一种人巨核细胞白血病细胞系，是从一个巨核细胞白血病患者的血液中建立的。这种细胞系具有悬浮生长的特性，倍增时间大约为24-30小时，至少89%的细胞可以与血小板糖蛋白（GP）lb和Ilb/llla及血型糖蛋白单克隆抗体反应。DAMI细胞:人巨核细胞白血病细胞系系不与抗淋巴腺、单核细胞、粒性白细胞、巨噬细胞抗原的抗体反应，因此是一种非常有价值的细胞系，为研究巨核细胞生化及分化提供了极好的模型。

该细胞系具有以下特点：

来源：DAMI细胞:人巨核细胞白血病细胞系来源于人巨核细胞白血病组织，经过多次传代和筛选，形成了一个相对稳定的细胞系。

形态特征：DAMI细胞:人巨核细胞白血病细胞系呈多边形或长条形，大小约为15-30微米，胞质丰富，核大而圆，核仁明显。

生长特性：DAMI细胞:人巨核细胞白血病细胞系生长迅速，传代周期约为24-48小时，可在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中稳定生长。

侵袭转移特性：DAMI细胞:人巨核细胞白血病细胞系具有较强的侵袭和转移能力，可通过Transwell小室实验等方法检测其侵袭和转移能力。

其他特性：DAMI细胞:人巨核细胞白血病细胞系还具有一定的增殖能力，可用作研究巨核细胞白血病细胞增殖相关疾病的模型。

DAMI细胞:人巨核细胞白血病细胞系

DAMI细胞:人巨核细胞白血病细胞系:人巨核细胞白血病细胞系培养操作

1)复苏DAMI细胞:人巨核细胞白血病细胞系:人巨核细胞白血病细胞系：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)DAMI细胞:人巨核细胞白血病细胞系:人巨核细胞白血病细胞系传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)DAMI细胞:人巨核细胞白血病细胞系:人巨核细胞白血病细胞系冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

DAMI细胞:人巨核细胞白血病细胞系:人巨核细胞白血病细胞系可以用于依硫磷酸促进DAMI细胞:人巨核细胞白血病细胞系分化的初步研究

依硫磷酸（通用名：氨磷汀）是一种泛细胞保护剂，临床主要用于肿瘤放疗或细胞毒化疗的脏器保护。基础研究发现依硫磷酸还具有其他作用，包括类造血生长因子、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制细胞周期进程等，然而，这些作用并不能用经典的碱性磷酸酶途径解释，说明依硫磷酸还有其他作用途径。

以人巨核细胞白血病DAMI细胞:人巨核细胞白血病细胞系系为对象，观察依硫磷酸促进DAMI细胞:人巨核细胞白血病细胞系向成熟巨核细胞分化的作用，为前期临床研究提供理论依据。

方法：生物信息学预测依硫磷酸是否具有调控细胞分化的作用；细胞计数法检测依硫磷酸对DAMI细胞:人巨核细胞白血病细胞系增殖的影响，筛选依硫磷酸促进DAMI细胞:人巨核细胞白血病细胞系分化的合适浓度；流式细胞仪检测CD33、CD34、CD41a的表达，鉴定DAMI细胞:人巨核细胞白血病细胞系所处的分化阶段；Giemsa染色显示细胞核，倒置显微镜、透射电镜观察依硫磷酸（0.1mmol/L处理0、4、8、12天）对DAMI细胞:人巨核细胞白血病细胞系形态学的影响；流式细胞仪检测DNA倍体化及细胞膜CD41a、CD33表达的变化。Q-PCR和Western blot检测转录因子GATA-1、Fli-1、NF-E2在mRNA水平及蛋白水平表达的变化。

结果：1)生物信息学预测发现依硫磷酸可能调控细胞的分化，并得到依硫磷酸促进细胞分化相关的8个基因；

2) 本研究发现低浓度（0.1mmol/L）依硫磷酸能促进DAMI细胞:人巨核细胞白血病细胞系向成熟巨核细胞分化，而高浓度（>1mmol/L）则明显抑制DAMI细胞:人巨核细胞白血病细胞系增殖；

3) 依硫磷酸（0.1mmol/L）能诱导DAMI细胞:人巨核细胞白血病细胞系由原始巨核细胞向成熟巨核细胞分化。表现为依硫磷酸处理第12天，DAMI细胞:人巨核细胞白血病细胞系出现血小板分界膜系统，直径>20μM的细胞比例较对照增加24.63%，细胞表面CD41a Mean值增加206.43，CD33表达阳性率下降13.98%；和对照比，DNA倍体化2N下降20.93%，4N增加15.93%，8N增加8.62%，16N增加3.41%；

4）Q-PCR和western blot结果显示，巨核细胞分化相关转录因子GATA-1、Fli-1、NF-E2在mRNA水平及蛋白水平表达没有升高。

结论：1)不同浓度依硫磷酸对DAMI细胞:人巨核细胞白血病细胞系作用不同，低浓度（0.1mmol/L）诱导分化，高浓度（>1mmol/L）抑制其增殖；2)DAMI细胞:人巨核细胞白血病细胞系分化表现在细胞体积增大，产生血小板分界膜系统，细胞CD41a表达增加，CD33表达下降，DNA倍体化增加；3）巨核细胞分化相关转录因子GATA-1、Fli-1、NF-E2在mRNA及蛋白水平表达没有升高，需要进一步研究其转录活性的变化。

参考文献

[1]Alteration in the expression of cdk4 and cdk6 proteins in oral cancer and premalignant lesions[J].SopeePoomsawat;WaranunBuajeeb;Siribang‐onKhovidhunkit;JirapaPunyasingh.Journal of Oral Pathology&Medicine,2010(10)

[2]MicroRNA expression profiling of megakaryocytes in primary myelofibrosis and essential thrombocythemia[J].Kais Hussein;;Katharina Theophile;;Wiebke Dralle;;Birgitt Wiese;;Hans Kreipe;;Oliver Bock.Platelets,2009(6)

[3]Multipotent Progenitor Cells Are Present in Human Peripheral Blood[J].Daniela Cesselli;;Antonio Paolo Beltrami;;Silvia Rigo;;Natascha Bergamin;;Federica D’Aurizio;;Roberto Verardo;;Silvano Piazza;;Enio Klaric;;Renato Fanin;;Barbara Toffoletto;;Stefania Marzinotto;;Laura Mariuzzi;;Nicoletta Finato;;Maura Pandolfi;;Annarosa Leri;;Claudio Schneider;;Carlo Alberto Beltrami;;Piero Anversa.Circulation Research,2009(10)

[4]MicroRNA-Mediated Control of Cell Fate in Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitors[J].Jun Lu;;Shangqin Guo;;Benjamin L.Ebert;;Hao Zhang;;Xiao Peng;;Jocelyn Bosco;;Jennifer Pretz;;Rita Schlanger;;Judy Y.Wang;;Raymond H.Mak;;David M.Dombkowski;;Frederic I.Preffer;;David T.Scadden;;Todd R.Golub.Developmental Cell,2008(6)

[5]汪海涛.依硫磷酸促进Dami细胞分化的初步研究[D].中国人民解放军医学院,2015.